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《中国农业科学院》 2012年
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表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热弱毒疫苗株的研究

王喜军  
【摘要】:狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的一种人兽共患传染病,在全球范围内流行,以急性、渐进性和致死性脑炎为特征。狂犬病是目前病死率最高的传染病之一,一旦出现神经症状病死率几乎高达100%。全球每年死于狂犬病的人数高达55,000,主要发生在非洲和亚洲的发展中国家。近年来,我国狂犬病疫情呈现了快速回升的趋势,每年造成的死亡人数均在2,000以上,已经成为一个严重的公共卫生问题。据统计,99%以上人间狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬伤所致。对于人间狂犬病的控制,最有效的措施是通过疫苗接种从源头上控制犬狂犬病。传统的狂犬病弱毒疫苗成本低廉,但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患;灭活疫苗安全、有效,但成本昂贵。因此,研制安全、有效,成本低廉的动物狂犬病疫苗,仍具现实意义。 反向遗传技术的发展与成熟使得不分节段的单股负链RNA病毒作为疫苗载体成为可能。犬瘟热(Canine distemper, CD)是由副粘病毒科的犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的犬、貂和狐狸等肉食动物的一种重要传染病,在全球广泛分布,严重影响着养犬业及经济动物养殖业的健康发展。弱毒疫苗接种能有效预防该病,应用广泛。利用CD弱毒疫苗株为载体,构建重组二联活疫苗,可实现一苗两防,有利于提高狂犬病免疫覆盖率,提高免疫质量,节省狂犬病免疫的经济成本。 为此,本研究以我国生产中应用的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8为亲本毒株,建立了该毒株的反向遗传操作系统。救获的犬瘟热弱毒疫苗株rCDV保持了野生型CDV/R-20/8的细胞培养生长特性,二者在Vero细胞上的多步生长曲线基本一致,生长滴度在相同的时间内达到峰值,最高生长滴度均为1×10~(6.5)TCID_50/mL。为评估CDV作为活病毒载体表达外源蛋白基因的潜力,构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组犬瘟热病毒rCDV-EGFP。重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞上的生长特性与亲本株rCDV相似,最高生长滴度可达1×10~(6.5)TCID_50/mL。该重组病毒具有良好的Vero细胞生长适应性及遗传稳定性,在Vero细胞上连续传代10代次后,仍能稳定、高效的表达EGFP。结果表明,CDV疫苗株CDV/R-20/8具有作为活病毒疫苗载体的潜力,为研制防制狂犬病和犬瘟热的重组二联活载体疫苗奠定了基础。 在此基础上,进一步构建了表达RV弱毒疫苗株ERA G蛋白的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-RVG。该重组CDV保持了亲本毒株rCDV对Vero细胞的良好适应性和稳定性,可达到高水平的生长滴度,最高生长滴度可达1×10~(6.25)TCID50/mL。rCDV-RVG和rCDV按3×10~4TCID_50/30_μL/只和1×10~5TCID_50/100_μL/只的剂量,分别经脑内和肌肉注射途径接种小鼠,观察3周,所有接种小鼠未见任何明显的狂犬病症状;rCDV-RVG和rCDV无论肌肉接种小鼠,还是脑内接种小鼠,与相应的PBS接种对照小鼠相比,观察期间的体重变化均无显著性差异。结果表明,RV G蛋白基因的插入、表达并没有增强疫苗载体CDV对小鼠的致病力。同时,rCDV-RVG按1×10~5TCID_50/100_μL/只的剂量经肌肉注射途径接种小鼠,可诱导显著的RV中和抗体反应。免疫后3周应用致死剂量的RV街毒GX/09株进行攻击。结果免疫小鼠全部获得保护,而对照小鼠全部发病死亡。结果表明,rCDV-RVG对小鼠具有的良好的生物安全性和的免疫原性。 为进一步评估重组病毒对犬的免疫原性,rCDV-RVG和rCDV分别按1×10~6TCID_50/1mL/只的剂量,经肌肉注射途径接种3月龄比格犬5只,初次免疫后3周以相同剂量、途径加强免疫一次。免疫后持续观察,定期检测免疫犬血清中CDV和RV中和抗体。结果rCDV-RVG初次免疫后1周和3周,免疫犬血清中的RV中和抗体滴度平均值分别为1.48IU和32.11IU。第二次免疫后2周,RV中和抗体反应显著增强,其平均值可达96.71IU。rCDV-RVG诱导的RV中和抗体反应可持续一年以上,初次免疫后70周,免疫犬血清中的RV中和抗体滴度平均值仍0.5IU,即保护动物抵抗致死剂量RV街毒攻击的最小滴度。结果提示,重组病毒rCDV-RVG两次免疫接种,可为免疫犬提供1年以上的有效保护。免疫后70周进行第3次免疫,结果诱导更为显著的加强免疫反应,第3次免疫后1周,血清RV中和抗体滴度平均值升至281.4IU。与此同时,rCDV-RVG和rCDV初次免疫后3周,均诱导显著的CDV中和抗体反应,第二次免疫后CDV中和抗体水平迅速上升。一年后进行第3次免疫,二者均可诱导更加显著的加强免疫反应,而且rCDV-RVG诱导的CDV中和抗体滴度峰值与亲本株rCDV的相比无显著性差异。 本研究结果表明,重组病毒rCDV-RVG具有良好的生物安全性和免疫原性,是一个有希望的新型狂犬病、犬瘟热重组二联活疫苗候选株。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S855.3

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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