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《中国农业科学院》 2012年
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ClassⅠ新城疫弱毒的毒力演化及自噬在新城疫病毒感染肿瘤细胞中的作用

孟春春  
【摘要】:由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的新城疫(Newcastle disease, ND)是一种可导致多种禽类发病死亡的烈性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为必须报告的疾病之一。NDV在分类上属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Avulavirus),是一种单股、负链、不分节段有囊膜的RNA病毒。虽然NDV目前只有一个血清型,但根据基因组结构和遗传距离可将所有的毒株划分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两大分支。Class Ⅱ分支由11个(I~XI)基因型组成,自1926年ND首次爆发以来,造成四次世界大流行的强毒株和现阶段常用弱毒疫苗株均属于Class Ⅱ分支。Class Ⅰ分支有9个(1-9)基因型,2006年被首次报道存在,目前所有的自然分离株均为弱毒株,但尚未见有关Class Ⅰ弱毒株的免疫原性,毒力进化趋势和病毒拯救等相关报道。为了更好地研究Class Ⅰ NDV的生物学特性,我们开展了如下研究: 1)一株鸭源Class Ⅰ NDV Duck/JS/10的分离及全基因组测序。参照GenBank上公布的ClassI NDV的全基因组序列,寻找各毒株间同源性比较高的区域这设计12对引物,使相邻引物对扩增的片段之间有部分核酸序列重叠区,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出覆盖除基因组末端序列之外的全部基因组内部序列;使用本实验室自行建立的简化RACE法获得基因组两端序列,将获取的序列用DNAstar软件拼接和分析。Duck/JS/10株的全基因组核酸序列由15198个核苷酸组成,较Class Ⅱ毒株在P基因编码区多出12个碱基;根据F基因绘制的遗传发生树显示Duck/JS/10属于北美流行的基因4型,这是我国首次分离到该型毒株其F蛋白裂解位点的序列为112EQQERL117,HN蛋白的长度为585个aa。将Duck/JS/10与21株NDV不同基因型的代表毒株进行同源性比较,结果显示其与DE-R49/99株遗传距离最近,与Gamefowl/US株遗传距离最近;全基因组和各基因序列同源性基本相同,这表明NDV的进化是由多基因共同决定的结果。已将Duck/JS/10的全基因序列上传至Genbank,登陆号为:HQ008337。 2)Duck/JS/10与常用疫苗株La Sota的免疫原性比较。为了比较两者的免疫原性差异,我们首先制备了Duck/JS/10和La Sota的高免血清并对不同基因型的NDV毒株对进行交叉血凝抑制试验。比较后发现,Duck/JS/10的抗血清对所选的强毒株的HI效价均高于La Sota的抗血清。随后选取了5株强毒与两种血清分别进行细胞交叉中和试验,鸡胚交叉中和试验;结果显示Duck/JS/10的抗血清对所有强毒株的中和效价均高于La Sota抗血清3-5倍。最后我们将Duck/JS/10和La Sota分别免疫SPF鸡,然后用Class Ⅱ基因VⅡ型强毒株ZJ1攻毒,比较两者的免疫效果。结果显示上述两者均能提供100%的保护,但Duck/JS/10能显著降低免疫鸡群攻毒后的排毒率。上述试验表明Duck/JS/10有望成为新的弱毒疫苗候选株。 3)Class Ⅰ弱毒株与Class Ⅱ弱毒株的毒力进化研究。选择2株Class Ⅰ弱毒株,Duck/JS/10和ZJ/3/10/Ch株,两株Class Ⅱ弱毒株La Sota株和I2株,分别通过气囊连续传10代和鸡胚连续传20代来比较亲本株和传代株的生物学特性差异。Duck/JS/10株经气囊传第三代后F裂解位点开始有突变,传至第10代其F裂解位点已由弱毒特征的112ERQERL117完全突变为强毒特征的112KRQKRF117;Duck/JS/10-A10的MDT为48.4h,ICPI为1.91,IVPI为2.08符合强毒标准。其余三株病毒经气囊传代10次后毒力未发生变化,而且所有病毒经鸡胚传代20次后毒力均未发生变化。 为了比较Duck/JS/10经气囊和鸡胚传代后与亲本株之间各基因的突变位点,我们对Duck/JS/10-A10和Duck/JS/10-E20进行了全基因组测序。结果:经比对Duck/JS/10-A10与Duck/JS/10共有47个碱基发生变化,其中有25个为有义突变;Duck/JS/10-E20与Duck/JS/10共有21个碱基发生变化,有义突变12个但巧合的是其中11个在Duck/JS/10-A10亦存在;这表明这11个位点在传代过程中容易突变,或许是病毒不稳定的遗传标记。随后进行了亲本株与传代株在体内增殖和同居感染实验,结果:Duck/JS/10-E20在体内的增殖水平及同居感染能力均较Duck/JS/10有所下降,而Duck/JS/10-A10在体内的增殖能力以及同居感染能力均较Duck/JS/10有所上升。这表明Duck/JS/10经气囊传代是毒力强化过程,而经鸡胚传代则是毒力弱化过程。 4)Duck/JS/10感染性克隆的初步建立。参照Duck/JS/10株的全序列,设计7对引物,经RT-PCR法从Duck/JS/10株感染的尿囊液中扩增得到目的片段后,分别克隆进T-easy载体中。将基因组3’和5’两段序列,先连入转录载体TVT7R中,得到TVT-35;然后将扩增片段依次亚克隆到T载体中,构建了中间质粒T-AA,该质粒经AflⅡ酶切后,回收大片段与经同样酶切的TVT-35相连,进而构建了含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-Duck/JS/10。将NP和P的扩增片段直接克隆至PCI-neo上,构建成PCI-NP和PCI-P;先将L1和L2扩增后先克隆进T-easy载体再克隆至表达载体PCI-neo中构建成PCI-L。将三个辅助质粒同NDV9a5b株微型基因组(TGL)共转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞,转染后48h在细胞中出现了明显的绿色荧光,表明三个辅助质粒具备了启动基因组复制和转录的功能,这为后续开展拯救病毒打下了坚实基础。 另本论文还开展了细胞自噬在NDV感染肿瘤细胞后对病毒增殖的相关研究。首先构建了用于检测细胞自噬GFP-LC3Ⅱ的真核表达质粒并对其功能进行验证;然后分别通过电镜,免疫印迹和GFP-LC3B的转染证实了NDV感染肿瘤细胞后可以引起自噬,而且有剂量依赖性;接着我们将NDV热灭活后与肿瘤细胞共孵育但没有检测到自噬,因此推测NDV诱导的自噬与病毒受体无关。此外我们首通过WB验证了NDV感染后I型和ⅡI型PI3K通路的活化情况,证实了在NDV诱导的细胞自噬中,ⅡI型PI3K通路被激活。然后分别使用体外药物抑制自噬和siRNA干扰自噬关键基因,结果均证实刺激自噬能够促进病毒复制,抑制自噬能降低病毒的滴度。由此我们提出结论:NDV感染后引起的自噬有助于病毒复制。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
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