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格氏线虫表皮免疫抑制蛋白的研究

刘华  
【摘要】:昆虫病原线虫是广泛使用的重要生防因子,在侵染寄主的过程中能够抑制或逃避昆虫免疫反应。格氏线虫表皮上的免疫抑制蛋白是保护线虫不受昆虫免疫反应伤害的重要因素。为了研究免疫抑制蛋白的作用机理,并将其应用于生物防治工作中,本研究分离纯化了格氏线虫表皮免疫抑制蛋白,克隆、表达了免疫抑制蛋白基因,验证了其功能;进行了免疫抑制蛋白的定位,初步探索了其作用机理;进行了免疫抑制蛋白应用于生物防治的初步尝试。 本研究获得的主要成果如下: 1.克隆了免疫抑制蛋白的基因 从表皮蛋白粗提物中分离纯化了一个具有抑制昆虫血细胞吞噬作用的蛋白组分,经过双向电泳分离和二级质谱鉴定,获得了免疫抑制蛋白的序列信息,证实其与其他物种的烯醇化酶相似性很高。根据同源性较高的烯醇化酶基因序列保守区设计了简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从侵染期格氏线虫中克隆到了免疫抑制蛋白的编码基因。序列分析证实免疫抑制蛋白与多个物种烯醇化酶具有较高同源性,具备烯醇化酶家族的各种特征,将其命名为Sg-ENOL。 2.表达了Sg-ENOL蛋白并制备了抗体 利用pGEX-6p-1载体在大肠杆菌中成功表达了Sg-ENOL,通过酶切和多步纯化获得了高纯度的无标签重组Sg-ENOL。重组Sg-ENOL能转化2-PGE为PEP,具备烯醇化酶的酶学活性。制备了重组Sg-ENOL的兔源多抗血清,用proteinA亲和纯化获得了高特异性的多克隆抗体。 3.定位了天然Sg-ENOL,初步研究了其作用机理 免疫电镜分析证实天然Sg-ENOL定位于线虫表皮上,同时发现Sg-ENOL也存在于线虫肌肉组织中。格氏线虫在昆虫源物质诱导下会分泌Sg-ENOL,而无诱导物时不会分泌。格氏线虫进入寄主体内后也会开始分泌Sg-ENOL,证实Sg-ENOL与格氏线虫侵染过程相关。 构建了重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达了Sg-ENOL。Sg-ENOL表达后保留在细胞质中,没有分泌到细胞外,证实了线虫具有特异的方式来分泌Sg-ENOL。 Sg-ENOL能够与人血纤维溶酶原特异结合,同时Sg-ENOL也能和昆虫血淋巴中蛋白结合,这表明昆虫体内的Sg-ENOL结合蛋白和人血纤维溶酶原很可能有相关性,为寻找Sg-ENOL在昆虫体内互作蛋白打下了基础。 4.将Sg-enol基因转化到了绿僵菌中,获得了高致病性工程菌 注射Sg-ENOL到东亚飞蝗体内,增强了绿僵菌的杀虫活性。 利用基因枪将连接在pbar-EX载体上的Sg-enol基因转化到了绿僵菌中,PCR检测结果证实了转化成功。转化株杀虫能力明显提高,能够显著影响东亚飞蝗的生存曲线,并缩短半数致死时间达25%(LT50),达到了用Sg-enol基因增强绿僵菌的杀虫能力的目的,充分显示了Sg-ENOL在生物防治上的应用潜力。


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