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《中国农业科学院》 2012年
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我国O型泛亚1系口蹄疫病毒表型差异的分子基础

白兴文  
【摘要】:本论文对3株不同宿主来源的O型泛亚1系口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)进行了分子变异和表型差异研究。经全基因组序列测定、核苷酸/氨基酸同源性比较分析,结果表明:1999年2株牛源分离毒(O/NX/CHA/99和O/HK/HB/CHA/99)和2008年1株猪源分离毒(O/ZheJ/CHA/8/2008)划分为PanAsia-1a和PanAsia-1b两个亚系。VP2的136(E-F环)、175位(G-H环)和214位(C-端),VP3的174位(G-H环),VP1的142、152、153位(G-H环)和199位(C-端)为这两个亚系的特征性氨基酸残基位点。BHK-21细胞、乳鼠毒力测定以及蚀斑形成和/或抑制试验结果显示:O/NX/CHA/99的毒力(TCID_50=6.625, LD_50=7.33)明显低于O/HK/HB/CHA/99(TCID_50=7.75, LD_50=8.33)和O/ZheJ/CHA/8/2008(TCID_50=7.875, LD50=8.5);O/NX/CHA/99呈小而密致的蚀斑,O/HK/HB/CHA/99呈大而浑浊的蚀斑,O/ZheJ/CHA/8/2008呈大而清晰的蚀斑;肝素钠可抑制O/NX/CHA/99的成斑能力,但完全不能抑制O/HK/HB/CHA/99和O/ZheJ/CHA/8/2008的呈斑水平。有趣的是,在CHO-K1细胞上,O/NX/CHA/99和O/HK/HB/CHA/99长斑,肝素钠可以完全抑制它们的成斑能力,而O/ZheJ/CHA/8/2008不长斑。提示O/NX/CHA/99具有与硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)受体的高亲和力,O/HK/HB/CHA/99可以利用HS受体,O/ZheJ/CHA/8/2008不能利用HS受体。 为了寻找决定O型泛亚1系FMDV蚀斑大小、利用HS受体的关键性氨基酸位点,以改造的不能利用HS受体的FMDV OZK93全长cDNA质粒作为基础骨架,利用定点突变和盒式替换策略,分别构建了12种VP3基因不同的嵌合全长cDNA质粒、3种不同VP1基因的嵌合全长cDNA质粒和22种VP0基因不同的嵌合全长cDNA质粒。经体内转录,分别拯救了9、3、13种VP3、VP1、VP0基因不同的嵌合病毒。BHK-21、CHO-K1和HS缺陷型细胞(pgsA745和pgsB618)的蚀斑形成和/或抑制试验结果显示,1)O/NX/CHA/99VP1基因的嵌合病毒不仅在BHK-21细胞上呈大小迥异的混合斑,肝素钠只能部分抑制其呈斑水平,而且在CHO-K1细胞上长斑,可被肝素钠完全抑制,同时在pgsA745和pgsB618上的成斑能力明显被抑制,说明它能够同时利用整联蛋白和HS受体;VP1基因区段是决定O/NX/CHA/99利用HS受体的功能区域,从序列比对和氨基酸性质推测K83可能是关键性氨基酸。VP2的Q80是决定O/HK/HB/CHA/99利用HS受体的关键性氨基酸。2)VP2的79位为H(碱性)的嵌合基因工程毒与该位点为Y(中性)的嵌合基因工程毒相比,蚀斑趋于变小;136位为E(酸性)的嵌合基因工程毒与该位点为G(中性)的嵌合基因工程毒相比,蚀斑趋于变大。VP4上第8位氨基酸残基S(亲水、极性)→A(疏水、非极性)对病毒与肝素的亲和力具有一定的辅助作用。 综合以上研究结果得出:1)猪源O型泛亚1系FMDV不能利用HS受体,而牛源O型泛亚1系FMDV能够利用HS受体;病毒与HS受体的结合效力与其在BHK-21细胞上的蚀斑大小和毒力有关。2)FMDV蚀斑形态差异与其衣壳蛋白上关键性作用位点的氨基酸残基性质改变有关。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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