旋毛虫分子鉴定研究与半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的克隆、表达及初步鉴定

【摘要】：旋毛虫是一种细胞内寄生性线虫,其生活史可以在同一宿主内完成,宿主感染谱极广,几乎所有的哺乳动物均可感染。旋毛虫感染引起的旋毛虫病是一种危害极其严重的食源性人兽共患寄生虫病。旋毛虫病的病原是毛形属的线虫,目前已经确定有8个种和4个基因型。由于不同旋毛虫种的地理分布、宿主范围、对宿主的感染性与致病性以及宿主对不同虫种的免疫应答等方面存在明显的差异,对旋毛虫分离株的种类鉴定,对旋毛虫病的病原学、免疫学、流行病学、临床学及防治等具有重要意义。半胱氨酸蛋白酶抑制因子是一类广泛存在于生物体的半胱氨酸蛋白酶高效内源性抑制剂。寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫逃避宿主免疫应答、适应寄生生活中发挥着重要作用。寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的免疫调控作用,在寄生虫入侵宿主时对宿主免疫应答的抑制起重要作用,是诱导宿主免疫抑制的重要因子之一。 本研究应用旋毛虫线粒体基因组核糖体RNA基因作为分子标记,建立了基于多重PCR的基因分型方法,可以鉴定欧亚大陆四个旋毛虫T. spiralis, T. nativa, T. britovi和T. pseudospiralis。以旋毛虫标准株T. spiralis和T. nativa为对照,应用线粒体核糖RNA基因多重PCR技术对我国11个旋毛虫分离株进行了鉴定,并且以5S rRNA基因间隔区(ISR)为分子标记,对其系统进化和聚类进行了分析,结果证实国内11个旋毛虫分离株中,河南邓县、陕西西安、黑龙江哈尔滨、天津、云南保山、云南大理、西藏那曲猪旋毛虫分离株以及内蒙古乌兰浩特犬株Trichinella sp-Tyl等9个分离株可归为T.spiralis;而吉林犬株与内蒙古乌兰浩特犬株Trichinella sp-Ty5分离株为T. nativa。5S rRNA基因间隔区序列分析表明,同一种内不同分离株之间序列高度保守。成功克隆了旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂TsCystatin基因家族的三个成员TsCystatinl, TsCystatin2和TsStefin。其开放阅读框分别为666bp,423bp和294bp,分别编码221,140和97个氨基酸,具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守结构域,TsCystatin基因家族在旋毛虫各个时期均可转录。在原核系统表达了TsCystatin基因,纯化后的TsCystatin重组蛋白具有蛋白酶抑制活性,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。