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超高压对花生分离蛋白凝胶特性的影响及其机理研究

何轩辉  
【摘要】:花生分离蛋白作为一种优质蛋白资源,由于其凝胶特性还未达到实际生产的需要,严重限制了其在食品工业中的应用。本研究对花生分离蛋白进行超高压处理,并对处理后的花生分离蛋白进行热凝胶、物化特性和结构特性的测定,明确物化特性、结构特性和凝胶特性之间的关系,探讨超高压对花生分离蛋白凝胶特性的改性机理。旨在改善花生分离蛋白凝胶特性以及为促进花生蛋白精深加工及高副加值转化奠定理论基础。 1确定了超高压改善花生分离蛋白凝胶性的最佳处理条件,考察了不同压力、不同时间、不同蛋白质浓度和不同pH值对花生分离蛋白热凝胶硬度、弹性和粘结力的影响,进一步以凝胶硬度为考察指标,通过正交旋转组合试验对超高压处理参数进行了优化,得出超高压改性花生分离蛋白(PPI)热凝胶性的最优参数为:压力115MPa,时间5min,PPI浓度3.11%,在此条件下PPI凝胶实际硬度为174.37,弹性和粘结力分别为0.78和0.32。 2研究了超高压对花生分离蛋白物化特性的影响。不同超高压参数处理的PPI持水性、持油性和凝胶硬度较未处理PPI均有显著性提高(p<0.05),在最优超高压处理条件下,其持水性增加8.9%,持油性增加50.0%,凝胶硬度增加50.6%,而凝胶弹性差异不大。与商业大豆分离蛋白(SPI)相比,持油性和凝胶硬度均显著性高于SPI(p<0.01),但持水性低于SPI(SPI溶解型除外)。 SDS-PAGE结果表明超高压处理对PPI中伴花生球蛋白Ⅱ有显著性影响,在200MPa时,PPI样品的伴花生球蛋白Ⅱ相对含量由原来的16.0%降为2.6%,条带基本缺失。DSC扫描分析表明天然花生分离蛋白有两个吸热峰,分别为伴花生球蛋白和花生球蛋白的吸热峰,其变性温度分别为93.53℃和107.25℃。超高压处理改变了PPI的热稳定性,在50-200MPa范围内,压力超过150MPa后,伴花生球蛋白吸热峰未见,此时其完全变性。PPI的总焓值(△H)随压力的增加逐渐降低。结合样品凝胶硬度结果表明,当伴花生球蛋白变性加剧时,其凝胶硬度也出现急剧降低。 花生分离蛋白的粒径经超高压处理后明显变小,100MPa样品粒径最小,为6.77um,较未处理样品粒径减小了69.76%,同时此条件下样品形成凝胶硬度最高。可见当PPI粒径减小到一定程度时,有利于凝胶硬度的改善。 采用激光光散射法对花生分离蛋白的分子量分布分析结果表明未经超高压PPI主要有两个峰,分子量分别为3.648e5Da组分(I)和2.327e5Da组分(II),含量分别为70.87%和29.13%。经高压处理后,PPI中组分(I)逐渐分解,到200MPa时组分(I)含量下降到36.08%,而组分(II)增加到62.95%,且出现了少量分子量更大的组分。结合各样品凝胶硬度结果分析可知,当PPI中两组分含量基本各占50%时,其凝胶硬度较好,且样品中大聚合物的存在不利于凝胶硬度的改善。 采用酸水解法对PPI中氨基酸(AA)组成进行分析。结果表明超高压未改变花生分离蛋白的AA组成,但超高压处理后AA总量和各AA含量均有轻微的提高(胱氨酸除外),含量最高的三种AA依次为谷氨酸、天门冬氨酸和精氨酸,其总量分别占各样品AA总量的55%左右。进一步分析可知样品中AA组成和含量对凝胶硬度的影响不显著。 3研究了超高压对花生分离蛋白二级结构的影响。结果表明PPI在溶液中的二级结构为:-螺旋含9.6%、β-折叠含32.1%,β-转角含10.6%和无规则卷曲含47.7%;PPI粉末的二级结构为:ɑ螺旋含13.35%,β折叠45.71%,β转角含28.10%和无规卷曲含12.84%。经过不同超高压处理后,圆二色谱和红外光谱结果均表明花生分离蛋白二级结构发生了显著性变化,与未处理相比,在100MPa时,ɑ螺旋分别增加了31.8%和14.58%,而β折叠分别减少了28.9%和12.87%,此条件下样品形成凝胶的硬度最高。同时两种测试手段虽由于样品处理不同结果不尽相同,但均表明超高压处理后ɑ螺旋含量有明显增加,而β折叠含量有明显减少,结合样品凝胶硬度结果分析可知,PPI中二级结构的改变会导致凝胶硬度发生改变,且当ɑ螺旋含量增加至一定程度,β折叠含量减少至一定水平时有利于凝胶硬度的改善。 4研究了超高压对花生分离蛋白三级结构的影响。与未处理相比,随压力的增大,PPI巯基含量先由4.10μmol/g pro增加至4.78μmol/g pro,后逐渐减少至1.92μmol/g pro,二硫键含量由44.22μmol/g pro逐渐增大至66.18μmol/g pro;随着浓度和时间的增大,巯基和二硫键含量均先增大后减少;超高压有助于PPI中巯基的暴露,同时部分巯基发生氧化形成二硫键。在巯基含量为4.29μmol/g pro,二硫键含量为59.55μmol/g pro时,样品形成凝胶的硬度最大。荧光光谱分析可知随着压力、浓度、时间的增大,PPI的表面疏水指数先增大后减小,与未处理相比,表面疏水指数均有提高,在100MPa、5min、5%条件下达到最大,为6.09,表明PPI在超高压处理后结构变得更为松散。 5采用质谱法分析得出花生分离蛋白中伴花生球蛋白Ⅱ中含有580个氨基酸,经超高压后其一级序列未发生变化,进一步对其空间构象进行模拟,伴花生球蛋白Ⅱ的结构变得更为疏松,大量的β-转角和β-折叠构象转变为无规则卷曲构象,进一步表明经超高压处理使花生分离蛋白结构变得更为松散。


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