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《中国农业科学院》 2013年
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烟草钙依赖蛋白激酶基因克隆与分析

康乐  
【摘要】:钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)作为钙信号传导通路中关键的传感器,其功能特性尤为重要,因为CDPKs在植物生长发育及应对各种不同环境刺激过程中均具有重要作用。因此,本文的主要研究内容包括以下两方面:一是利用同源克隆技术进一步从普通烟草中分离获得CDPK基因,并对其序列特征、进化关系及表达情况进行分析;二是获得所分离CDPK基因的RNAi植株,从而对基因的相关功能进行初步的探索与分析。通过以上两方面的研究,本文得到的主要研究结果如下: (1)采用RACE技术从普通烟草中克隆得到了4个CDPK基因,分别命名为NtCDPK13、NtCDPK14、NtCDPK15和NtCDPK16(GenBank登录号分别为JN662018、JN662019、JN662020和JN662021);多序列比对结果表明4个基因的编码产物均具有典型的CDPK保守序列,C末端调控区都有4个EF手性结构;系统进化树分析结果表明,NtCDPK13、NtCDPK14及NtCDPK16可能是普通烟草中特有的基因,而NtCDPK15可能来源于绒毛状烟草,同时,预测旁系同源基因NtCDPK15与NtCDPK1在功能上可能非常保守。 (2)定量RT-PCR分析结果表明,4个CDPK基因在烟草根、茎、叶三个组织中均有不同程度的表达。高浓度盐、干旱以及ABA胁迫条件下基因的表达情况为,NtCDPK13不受三种胁迫诱导;NtCDPK14受盐胁迫诱导后在根中显著表达;NtCDPK15受盐胁迫诱导后在茎和叶中的表达量显著增加,受ABA胁迫诱导后在根中表达量增加;NtCDPK16受三种胁迫诱导后在根中显著表达。 (3)利用Gateway技术构建了NtCDPK14和NtCDPK16的RNAi表达载体,并采用农杆菌介导的烟草遗传转化法获得了这2个基因的T0代RNAi植株;潮霉素鉴定结果显示,T0代阳性率在70%以上;进一步培养后获得T1代RNAi植株,潮霉素及目的片段在DNA水平上的鉴定结果显示,T1代阳性率在75%-85%之间;利用定量RT-PCR技术检测NtCDPK14和NtCDPK16在RNAi植株中的表达量,结果显示,这2个基因的表达真正受到了干扰。 (4)通过对T1代阳性RNAi植株的盐胁迫诱导的初步分析表明,NtCDPK14和NtCDPK16在正常条件下对烟草幼苗的根生长可能没有影响,但对盐胁迫条件下根的伸长生长可能具有正调节作用。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S572

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