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《中国农业科学院》 2013年
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哈茨木霉Th-33 Thga1基因的克隆及功能研究

刘增亮  
【摘要】:哈茨木霉对植物病害的防治机制有竞争作用、重寄生作用及诱导寄主植物产生防卫反应等。上述过程都与哈茨木霉的细胞信号传递密切相关,因此研究哈茨木霉是如何感知病原菌并传递其信号及调控细胞的反应等过程的信号传递系统,对于阐明哈茨木霉的生防机制具有重要意义。G蛋白偶联信号传导系统是一类重要的细胞信号传导途径,参与调控丝状真菌的生长、产孢、致病性等生命活动。G蛋白由α、β、γ3个亚基组成,各个亚基由独立的基因编码,其中Gα亚基是功能亚基。因此研究Gα基因及其功能特性,对于揭示哈茨木霉的信号传递及调控的作用机制具有重要的意义。本文克隆得到哈茨木霉中的I型Gα基因,对其进行生物信息学分析并通过基因敲除技术得到敲除突变株,观察其表型和拮抗效果变化,探究其功能,结果如下: 1.以哈茨木霉Th-33基因组DNA为模板,PCR获得了1203bp的Gα基因同源片段,结合Genomewalking技术进行延伸,最终获得Gα基因及其侧翼序列共3673bp,其中Gα基因全长1283bp,Gα基因的cDNA序列1062bp,将该基因命名为Thga1(登录号JN874387)。 2.Thga1基因序列中共有4个外显子和3个内含子,编码353个氨基酸,序列比对和同源性分析显示Thga1属于I型Gα基因,编码的氨基酸序列与绿木霉TgaA和深绿木霉Tga1蛋白同源性分别为100%、99%。 3.以潮霉素基因作为筛选标记,Thga1基因两侧序列作为同源臂构建打靶载体pDHt/sk-Gα-Hyg;采用农杆菌介导转化法将打靶载体导入哈茨木霉Th-33基因组中,通过分子验证得到两株Thga1基因敲除突变株1-1和10-1。 4.对两株敲除突变株进行了表型分析:在PDA培养基上的菌落形态变化明显,菌落较薄,菌丝分布不均匀;两株敲除突变株的生长速度和产孢量较之野生型有明显的下降,其中突变株1-1产孢量最少,和野生型相比相差两个数量级;观察孢子萌发发现敲除突变株1-1和10-1的分生孢子萌发时间明显出现延迟,相比于野生型Th-33延迟20h左右,而且分枝较少;突变株1-1、10-1的分生孢子梗分枝简单,非常稀疏,二级分枝和瓶梗较少。 5.对两株突变株的拮抗效果进行了分析:平板拮抗实验表明两株突变株相比于野生型对立枯丝核菌、辣椒疫霉菌的竞争作用降低,无法对病原菌菌丝进行覆盖和重寄生;两株突变株产生的挥发性代谢产物对立枯丝核菌、辣椒疫霉菌的抑制效果均率显著低于野生型;两株突变株产生的非挥发性代谢产物对立枯丝核菌、辣椒疫霉菌的抑制率相比于野生型均有不同程度的降低,其中突变株1-1对立枯丝核菌抑制率和野生型差异不显著,而突变株1-1对辣椒疫霉菌以及突变株10-1对两种病原菌的抑制率和野生型相比,差异均达到了显著水平。显微镜观察发现野生型可以对立枯丝核菌菌丝进行缠绕,并产生附着枝或钩状分枝吸附于病原菌的菌丝上,穿透病原菌的菌丝,但两株突变株1-1、10-1和立枯丝核菌的相互作用过程中没有发现类似的重寄生现象。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S476.1

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【参考文献】
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