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《中国农业科学院》 2014年
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农杆菌介导的白菜高效遗传转化体系研究

贾艳丽  
【摘要】:随着白菜全基因组测序的完成,白菜开始成为植物功能基因组研究的模式植物,白菜基因的功能研究需要有一个高效的白菜遗传转化体系为基础。然而,白菜遗传转化困难,已成为影响白菜基因挖掘和功能研究的一大障碍。建立白菜的高效遗传转化体系具有重要的理论和实际意义。 本研究通过比较11个白菜品种的下胚轴再生频率,筛选出6种再生频率较高的基因型:不结球白菜品种南京矮脚黄(N1)、结球白菜品种天津2号(N2)、华良5号(N3)、红菜薹品种十月红(N4)、黄秧小白菜(N5)、和汉阳青小白菜(N11),并探讨了适宜各基因型遗传转化的卡那霉素的使用浓度。同时以N11下胚轴为外植体,研究了苗龄、共培养基的pH值、激素浓度和AgNO3浓度等因素对白菜遗传转化频率的影响,优化了农杆菌介导的的白菜遗传转化体系。以该遗传转化体系为基础,将抗虫基因Cry1Aa和SAD干扰载体分别导入到了白菜品种,成功获得转基因白菜植株。 主要研究结果如下: 1.从11个白菜基因型中筛选出6种再生频率较高的基因型,并确定了N1、N2、N4、N11基因型的适宜筛选剂Kan浓度应为25mg/L,N3和N5品种的适宜筛选剂Kan浓度应为20mg/L。 2.优化了农杆菌介导的遗传转化体系:以N11下胚轴为外植体,确定了最佳分化培养基激素浓度为Zeatin2.0mg/L、IAA0.1mg/L和AgNO30mg/L,共培养基最适pH值为5.8。 3.获得抗虫转基因白菜材料:构建了过表达载体PBI121-Cry1Aa,利用农杆菌介导法将抗虫基因Cry1Aa导入到N1、N2、N4和N11白菜品种中,平均转化频率分别为1.65%、0.52%、0.13%和3.65%。其中N11基因型共获得63株转基因抗性苗,经PCR鉴定其中61棵均为阳性转基因株,即抗性株阳性率达96.8%。N11基因型转基因T1后代5个株系植株分别经PCR、Southern blotting杂交证实,抗虫基因已经整合到汉阳青小白菜基因组中;实时荧光定量PCR证实,抗虫基因在转基因植株T1后代体内已正常进行了转录;网室和离体抗虫鉴定结果表明,5个株系与对照组相比,小菜蛾和菜青虫的幼虫死亡率均具有显著差异(P0.05),即均具有显著地杀虫效果,并且各株系之间的抗虫性没有明显差异。 4.获得SAD干扰载体的转基因白菜材料:为了获得高硬脂酸转基因材料,构建了SAD基因的干扰载体(SAD-RNAi)载体。基于本研究建立的农杆菌介导的白菜遗传转化体系,将反向重复抑制片段转入到汉阳青小白菜中,平均转化频率为1.81%,共获得转基因T0代植株15棵,经PCR验证均为阳性抗性苗。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S634

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