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《中国农业科学院》 2014年
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牛病毒性腹泻病毒感染形成和复制的分子机制研究

宫晓炜  
【摘要】:牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus, BVDV)感染引起的,以急慢性粘膜病、持续性感染和免疫抑制为主要特征的传染性疾病;该病被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疾病目录。目前BVDV感染宿主的范围不断扩大,流行趋势呈明显上升状态,给BVD防控计划的实施带来了严重的挑战。 病毒诱导的细胞自噬不仅介导细胞先天性抗病毒免疫反应,也参与病毒抗原的提呈;但很多病毒可演化出不同的机制来破坏、逃避和抑制自噬,甚至利用自噬来增强自身的繁殖。BVDV和宿主蛋白相互作用所导致的细胞损伤是BVDV致病的关键。目前有关BVDV与自噬及宿主蛋白相互作用的报道极为有限。本论文旨在从宿主角度探索BVDV感染复制的相关机制,并取得了如下成果: 1)近几年,我国西北地区流行的BVDV亚型主要是BVDV-1b、BVDV-1d及BVDV-1q。通过RT-PCR方法检测宁夏和青海奶牛血样及牦牛血样中BVDV的感染情况,结果显示BVDV阳性率分别为26.8%和24%。对5′UTR和Npro进行测序和遗传进化分析,证实流行的毒株主要为BVDV-1b、BVDV-1d及BVDV-1q三个亚型。此外,对BVDV抗原阳性的血样进行病毒分离,均为ncp型毒株;电镜和直接免疫荧光检测可观察到细胞中病毒粒子的存在。 2)制备高亲和力的兔抗-Core和兔抗Npro多克隆抗体。构建原核表达载体pET-30a-Core和pET-30a-Npro,转化BL21(DE3),经IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析纯化和电洗脱包涵体,获得浓度和纯度较高的Core和Npro重组蛋白,Western-blot检测具有很好的反应原性;利用纯化的蛋白制备兔抗血清,Western-blot和IFA检测表明,两种多克隆抗体均能识别BVDV病毒粒子和细胞中天然表达的Core和Npro蛋白,可用于后续的试验。 3)BVDV感染诱导的细胞自噬促进自身在细胞中的复制。通过透射电镜、Western-blot及荧光显微镜检测,发现BVDV oregon C24V感染MDBK细胞后24h,细胞质中会出现大量的自噬空泡;BVDV感染可引起LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化以及p62的降解;在GFP-LC3质粒转染的细胞,能看到增多的聚集颗粒。用药物抑制细胞自噬或干扰Beclin-1的表达,会降低病毒滴度和病毒蛋白的表达。 4)BVDV Core蛋白与PIAS4蛋白相互作用有利于BVDV的生长和复制。本研究以Core蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统从牛单核细胞文库中筛选出与其相结合的关键宿主蛋白(PIAS4);通过酵母回交试验和免疫共沉淀试验,证实Core蛋白和PIAS4发生相互作用;激光共聚焦显微镜观察二者在细胞质共定位;下调和上调细胞内PIAS4的表达,病毒滴度和Core蛋白的表达量会发生相应的下降和增加。 本论文研究和发现了宿主细胞内参与BVDV复制的核心元件,为进一步研究自噬和BVDV的互作及BVDV抗宿主免疫应答的机制提供了线索。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S852.653

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【参考文献】
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