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《中国农业科学院》 2014年
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牛乳腺上皮细胞中bta-miR-145功能的初步研究

李文清  
【摘要】:乳腺是动物成年后经历增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺发育和泌乳机理的研究对提高奶牛的生产性能及乳品质非常重要。microRNAs是一类在转录后调节基因表达的短的非编码RNA。从microRNA的角度研究其对奶牛乳腺发育和泌乳机理的调控是一个较新的研究领域。本试验选取在奶牛分娩前后有差异表达的bta-miR-145为研究对象,通过生物信息学分析、文献报道比较、3’RACE测序、细胞转染、RT-qPCR、Western Blotting、双荧光报告分析等方法在牛乳腺上皮细胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究内容如下: 1.为了挖掘更多的与bta-miR-145相关的信息,对bta-miR-145进行了生物信息学分析。通过MEGA5.05软件对牛的bta-mir-145进行种系发育分析,发现牛与人和猪的microRNA145同源关系较近;通过miR TarBase数据对miR-145进行已验证靶标收集,发现在人和小鼠上miR-145靶向IRS1;将Target Scan6.2预测的bta-miR-145的648个靶标带入DAVID数据库进行KEGG信号通路分析,发现大部分靶基因位于MAPK信号通路,其中包括IRS1;PicTar、miRanda、miRBase和miRGen这几个预测软件都预测到miR-145靶向IRS1,Target Scan6.2预测bta-miR-145靶向CSN2;通过RNAhybrid数据库对IRS1和CSN2的bta-miR-145的预测结合位点进行最小自由能分析,发现自由能都小于-15kcal/mol。以上结果表明bta-miR-145可能靶向IRS1和CSN2,并调节MAPK信号通路。 2.为了进一步确定bta-miR-145对牛的IRS1和CSN2基因的靶向关系,通过NCBI和Ensemble数据库对这两个基因进行3’UTR序列分析,结果发现牛的IRS1基因为预测基因,于是通过3’RACE的方法对牛IRS1的3’端进行快速扩增,然后利用Sequencher软件对扩增片段进行拼接,获得牛IRS13’UTR序列,进一步分析发现其上仍然存在预测的bta-miR-145的结合位点;CSN2基因的3’UTR序列在两个数据库中也有一些差异,但都存在预测的bta-miR-145的结合位点。 3.为了获取本研究的试验模型,采用机械破碎法成功获得增殖旺盛的原代牛乳腺上皮细胞,并对细胞进行纯化,纯化后的细胞及纯化后传二十代的细胞都检测到角蛋白-18的表达,表明仍然具有上皮细胞的典型特征。采用不同激素和细胞因子诱导乳腺上皮细胞,发现100ng/mLIGF-1可显著提高乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的基因表达,为后续试验提供了分泌功能的细胞模型。 4.为了探索最佳的转染条件,研究了细胞的接种密度、转染时RNAi与脂质体的添加量、bta-miR-145的过表达和抑制表达效果,结果表明:以5×104-1×105/mL的密度接种细胞可以满足转染时细胞汇合率50%的要求;转染时RNAi与脂质体2000选择(30)(1.5)组合(24孔板),可以达到最佳转染效率;150pmol/孔的mimic能够达到过表达bta-miR-145的效果,300pmol/孔的inhibitor能够达到抑制表达bta-miR-145的效果(6孔板)。 5.为了研究bta-miR-145对牛乳腺上皮细胞增殖的影响,将牛乳腺上皮细胞接种于96孔板,48小时后利用CCK-8试验盒进行检测,结果表明bta-miR-145对牛乳腺上皮细胞生长具有一定的调控作用。 6.为了研究bta-miR-145过表达和抑制表达是否会影响其它microRNA的表达,通过RT-qPCR的方法对bta-miR-214、bta-miR-181a、bta-miR-21进行检测,发现bta-miR-181a与bta-miR-145呈相同的表达趋势,bta-miR-214与bta-miR-145呈相反的表达趋势,bta-miR-21基本不受bta-miR-145过表达和抑制表达的影响。 7.为了研究bta-miR-145是否影响IRS1和CSN2的基因表达和蛋白表达,将bta-miR-145mimic和inhibitor转染入牛乳腺上皮细胞中,利用RT-qPCR和Western blotting方法分别检测细胞中IRS1和CSN2的mRNA及蛋白表达的变化。结果表明Bta-miR-145影响牛IRS1、CSN2的蛋白表达,但并不影响它们的mRNA表达。 8.为了研究bta-miR-145是否与IRS1和CSN2的3’UTR有相互作用,采用双荧光报告基因载体pmiR-RB-REPORTTM构建分别含有IRS1、CSN23’UTR的重组载体,将此重组载体与bta-miR145mimic一起转染入293T细胞。结果表明,以cel-miR-67作对照,bta-miR-145mimic没有引起IRS1和CSN2双荧光比值的明显下调,因此,bta-miR-145可能对IRS1和CSN2的3’UTR并没有明显的相互作用。 综上所述,bta-miR-145对奶牛乳腺发育和泌乳有一定的调控作用,它可以调节牛乳腺上皮细胞的增殖,调节IRS1和CSN2的蛋白表达,但并不调节它们的基因表达,一种microRNA的表达变化会引起其它一系列的microRNA发生变化,应以系统生物学的观点来解释相关的生物学现象。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S823

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