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《中国农业科学院》 2015年
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流产衣原体MIP蛋白的双抗原夹心ELISA诊断方法建立及单克隆抗体制备

蔺俊丽  
【摘要】:流产衣原体(Chlamydia abortus,C.abortus)是一种严格细胞内寄生的革兰氏阴性细菌,可感染妊娠母畜导致流产、死产或者弱胎等;也可引起公畜发生睾丸炎、尿道炎等症状;孕妇与感染的动物直接接触也会造成流产及全身感染等症状,因此流产衣原体是一种重要的人兽共患病病原。巨噬细胞感染增强蛋白(MacropHage Infectivity Potentiator,MIP)是一种脂蛋白,作为一种免疫显性抗原,参与衣原体感染,引起炎症反应等过程。本研究以MIP为研究对象,利用Gen Bank已公布的序列,设计引物,PCR扩增得到MIP蛋白的编码基因,经过酶切、连接、转化将其插入原核表达载体pET30a(+),成功构建表达载体pET-mip并转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE分析可见在27 kD处出现特异性条带,表明插入的mip基因成功表达;Western-blot特异性实验验证表达的MIP蛋白具有反应原性。以纯化的MIP蛋白做为包被抗原,HRP标记的MIP蛋白为酶标抗原,最适包被浓度为2.5μg/mL,血清最佳稀释度为1:100,建立双抗原夹心ELISA方法。建立的双抗原ELISA与IHA相比,敏感性高,符合率为89.3%;与支原体、嗜肺军团菌、口蹄疫等阳性血清无交叉反应;批间、批内CV%均小于11%,表明建立的双抗原夹心ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好。以纯化的MIP蛋白免疫Balb/c小鼠后筛选阳性细胞克隆并进行有限稀释克隆化,建立了两株能稳定分泌抗MIP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为M1和M3。间接ELISA法鉴定单抗上清抗体效价为1:1600;染色体鉴定符合杂交瘤细胞的特性;两株单抗50%最大结合浓度均为10μg/mL;Western-blot鉴定两株单克隆抗体能特异识别MIP蛋白;Mouse单克隆抗体亚类检测试剂盒鉴定2株单抗免疫球蛋白类型均为IgG1,轻链为κ链;鸡胚接种鉴定2株单抗能有效中和衣原体感染性。综上所述,本研究成功表达了流产衣原体MIP蛋白,建立了MIP蛋白双抗原夹心ELISA诊断方法,制备了抗MIP单克隆抗体,为流产衣原体的准确诊断及相关致病机制的研究和奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.67

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