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《中国农业科学院》 2013年
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大蒜根蒜氨酸酶基因的克隆和表达及RNAi沉默研究

唐巧玲  
【摘要】:大蒜有“药用植物黄金”之美称,其产生的特有化学物质蒜素(alliicin)及其相关的含硫化合物对健康有很大的裨益。蒜素是在大蒜的组织和细胞遭到破坏时,由蒜氨酸酶(alliinase,EC4.4.1.4)催化底物蒜氨酸(alliin)而产生。因此,蒜氨酸酶是大蒜中非常重要的酶类。目前的研究表明,大蒜鳞茎和叶片中的蒜氨酸酶与根中的不同,前者研究较多,特点清楚,后者研究较少。 本研究根据GeneBank登录的大蒜根蒜氨酸酶编码基因的部分cDNA序列,通过RACE技术克隆了它的未知序列,并扩增了它的全长cDNA序列和基因组序列。通过生物学软件对推测的氨基酸序列进行了特点分析。通过半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对不同蒜氨酸酶基因在不同大蒜组织中的表达量差异进行了分析。并且通过密码子优化和诱导表达条件的优化,成功建立了大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因在毕赤酵母表达系统pIC9K/GS115中的分泌表达。 此外,在参考国际和国内的已有研究成果的基础上,本研究还建立了基因枪介导的大蒜遗传转化体系。构建了用于沉默大蒜蒜氨酸酶基因表达的RNAi载体,转入受体植株。对转基因大蒜植株进行了PCR和Southern blot验证,分析了蒜氨酸酶基因在转录水平和蛋白水平的变化,以及目的基因的沉默效率。具体的研究结果如下: 1.从大蒜根中克隆了一种新的蒜氨酸酶编码基因。其cDNA序列全长2007bp,最大的ORF为1342bp,推导的蛋白序列463aa,分子量约为52.3kD,预测的pI为6.95。克隆的基因组序列长度为2217bp,包含3个外显子,2个内含子。推导的氨基酸序列与葱蒜类作物中已克隆的蒜氨酸酶序列进行比较发现,鳞茎与根中的蒜氨酸酶分处于两个分支中。大蒜根蒜氨酸酶和洋葱根Ⅰ型和Ⅱ型氨酸酶的相似性分别为70%和61%,而和大蒜鳞茎蒜氨酸酶的相似性仅为54%。 2.通过生物信息学软件对推导的氨基酸序列分析发现,N-末端存在信号肽序列,可能的切割位点在第29~30氨基酸之间;成熟蛋白序列中的保守结构域有:N-末端的类表皮生长因子结构域(EGF);中部的5'-磷酸吡哆醛(PLP)结合结构域,Lys287为可能的结合位点;还有天冬氨酸氨基转移酶(AAT)超家族结构域和C-末端的催化结构域。此外,在推导的氨基酸序列中还发现了4个可能的糖基化位点和9个Cys残基,推测可能形成4对二硫键和1个自由的硫醇基团。 3.通过Southern blot检测发现大蒜根蒜氨酸酶基因可能为基因家族编码。以克隆的大蒜actin序列为内参,利用半定量RT-PCR技术分析表明,鳞茎蒜氨酸酶基因在大蒜叶片、鳞茎中高表达,而根中不表达;根蒜氨酸酶基因在根中优势表达,在鳞茎和叶片中有少量表达。通过实时荧光定量PCR技术得出根蒜氨酸酶基因在根中的表达量分别是叶、鳞茎表达量的27倍和9倍。 4.以大蒜鳞茎蒜氨酸酶成熟蛋白的编码序列为基础,根据毕赤酵母的密码子偏好对基因序列进行了改造,合成了用于毕赤酵母表达的基因。通过对诱导表达条件的优化,成功实现了蒜氨酸酶基因在毕赤酵母表达系统pIC9K/GS115中的分泌表达。表达量最高的重组子为pPIC9K-Alliich/Pichia-54,诱导表达72h,蒜氨酸酶活性达到最高,酶活力为74.63U,比活力为68.95U/mg,108h后开始下降。与天然酶活性相比,重组表达的蒜氨酸酶活性相差较远。 5.初步建立了基因枪介导的大蒜遗传转化体系。以大蒜无菌苗根诱导的愈伤组织为受体进行基因枪转化,根据愈伤组织的形态特征设计了6组基因枪转化参数进行试验。结果表明,其中4组转化试验都获得了转基因植株;轰击距离9cm、压力1100psi和轰击距离12.5cm、压力1300psi各轰击1次的轰击方式获得了最高的转化效率,为2.4%。对抗性植株进行了PCR和Southern blot检测,证明pCAMBIA1301载体上的潮霉素抗性选择标记基因和gus报告基因已整合到抗性植株的基因组中。对转化后的愈伤组织、胚状体、根、再生芽尖和叶片进行gus基因的表达检测,抗性材料显示出明显的蓝色反应。 6.根据已经克隆的基因序列,构建了沉默蒜氨酸酶基因的6个RNAi植物表达载体,其中3个载体针对鳞茎蒜氨酸酶基因,3个是针对根蒜氨酸酶基因。通过基因枪介导的转化方法,将这些载体导入大蒜受体植株中,获得了转基因植株5株,全部为沉默鳞茎蒜氨酸酶基因。通过PCR和Southern blot检测证明,目的基因片段已经整合到转基因植株的基因组中。通过半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测发现,转基因植株中的鳞茎蒜氨酸酶基因转录水平明显下降,最高沉默效率达到90%以上。通过丙酮酸法测定酶活性发现,转基因植物中的蒜氨酸酶活性也明显下降,并且mRNA表达水平和酶活水平具有相关性。在同一转基因植株的不同组织中基因的沉默效率接近。但是转录水平的基因沉默效率要比蒜氨酸酶的酶活下降率要高得多。可能是因为这些植株中只沉默了鳞茎蒜氨酸酶基因,而根蒜氨酸酶基因仍有表达,丙酮酸法测定酶活并不能把它们分开。 这些研究结果为利用基因工程技术表达重组蒜氨酸酶提供了更多的基因资源和技术支持,也为研究不同蒜氨酸酶基因对大蒜食用品质的影响提供了参考。特别是大蒜遗传体系的建立为利用基因工程技术对大蒜进行遗传改良打下基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S633.4

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