碱性条件下苏云金芽胞杆菌的基础代谢分析

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于蜡样芽胞杆菌族,由于其对多种农业害虫具有特异性毒杀效果,目前已成为世界上应用范围广泛的微生物杀虫剂。Bt在形成芽胞的同时可以形成伴胞晶体,主要成分是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。研究发现,大多数鳞翅目昆虫的中肠是碱性且微氧的环境,而Bt进入昆虫体内后主要在中肠发挥毒杀作用,中肠碱性环境能够影响昆虫与细菌的互作,因此研究苏云金芽胞杆菌在碱性条件下的生存机制十分必要。本文根据Bt在碱性条件下的表达谱芯片,对Bt野生型菌株HD73的基因表达情况及基础代谢变化进行分析,构建了乳酸脱氢酶编码基因ldh2和转录调控因子编码基因crp的缺失突变体,探索这两个基因在碱性条件下的功能。在芯片数据中共发现有1401个基因存在差异表达变化,其中上调诱导表达的基因有662个,下调抑制表达的基因有739个。选取了48个差异基因进行Real Time PCR验证,其中31个基因与芯片数据趋势一致,10个基因与芯片数据趋势相反,7个基因未获得有效数据。将芯片数据与NCBI中的GO数据库及COG数据库进行富集分析及分布分析,发现在碱刺激条件下细胞的基础代谢明显加强:在COG分布分析中发现,诱导表达的基因主要分布碳代谢、氨基酸转运及代谢、脂类合成等21个途径中;在GO分析中发现细胞基础代谢途径明显富集:糖酵解的12个途径中有19个基因上调诱导表达,三羧酸循环的5个途径中有12个基因上调诱导表达,氨基酸的转运及合成、核酸物质的合成及转运等过程均存在上调诱导表达基因。丙酮酸脱氢酶编码基因ldh2在芯片数据中上调诱导表达35倍,采用同源重组技术敲除ldh2基因,构建了ldh2基因缺失突变株HD(△ldh2)。通过测定生长曲线发现:在Na OH终浓度为24mmol/L和30 mmol/L时,HD(△ldh2)的生长情况与野生型菌株HD73比无明显差异。转录调控因子编码基因crp在基因芯片中上调诱导表达21倍,采用同源重组技术敲除crp基因,构建了HD(△crp)突变体菌株。通过测定生长曲线发现:在Na OH终浓度为28 mmol/L时HD(△crp)恢复生长的速度较出发菌株慢,说明Crp蛋白在Bt应答外界碱性条件过程中发挥作用。将糖代谢过程乳酸脱氢酶编码基因ldh2(Gene ID:HD73_5189)、6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因glu F(Gene ID:HD73_0158)、转录调控因子编码基因crp(Gene ID:HD73_0493)、磷酸甘油变位酶编码基因phg(Gene ID:HD73_2700)的启动子分别与p HT304-18Z连接,构建Pldh2-lac Z、P0158-lac Z、P2700-lac Z、P0493-lac Z的融合载体,并将上述载体分别转入HD73菌株、HD(△crp)突变体中,通过测定?-半乳糖苷酶活性发现:乳酸脱氢酶编码基因ldh2在指数生长期受到转录调控因子Crp的控制,而HD73_0158、HD73_0493、HD73_2700的转录并不受转录调控因子Crp的调控。