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伪狂犬病病毒DNA聚合酶入核转运的分子机制

王一平  
【摘要】:伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)又被称为猪疱疹病毒1型或奥耶斯基病病毒,属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科水痘病毒属。PRV可引起家畜和多种野生动物发生伪狂犬病,其中猪是该病的主要宿主和传染源。PRV在多个国家均有流行,对养猪业危害极大,造成严重的经济损失。PRV DNA复制是一个复杂的过程,需要病毒编码的多种酶蛋白协同参与,其中病毒DNA聚合酶发挥关键作用。PRV DNA聚合酶包含2个亚基:催化亚基UL30和辅助亚基UL42。UL30具有天然的酶活性,能催化病毒DNA的合成,而UL42能将聚合酶全酶固定在DNA模版上,增强全酶的持续合成能力。PRV DNA聚合酶在细胞质合成后必须转运到细胞核中才能发挥功能,这是启动病毒DNA复制的先决条件。然而,PRV DNA聚合酶入核转运的分子机制尚未阐明。作为PRV DNA聚合酶的辅助亚基,UL42是否是病毒复制所必需的也还不清楚。本研究旨在阐明PRV DNA聚合酶UL42与UL30亚基入核转运的分子机制,并明确辅助亚基UL42在PRV DNA复制过程中的作用。为阐明PRV DNA聚合酶UL42与UL30亚基的入核通路,本研究经免疫荧光试验证实,UL42能独立定位于细胞核中,UL30主要定位于细胞质中,然而当UL42与UL30共表达时,UL30的细胞质定位完全转移为细胞核定位,表明UL30的入核转运依赖于UL42。对UL42和UL30进行缺失和定向突变分析发现,UL42在354~370位氨基酸包含一个功能性和可转移性的双分型核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),并证实K354、R355和K367是UL42双分型NLS保持完整结构和功能所必需的,然而UL30并无功能性NLS。免疫共沉淀试验结果表明,UL42与Importinα3(Impα3)和Impα4存在相互作用,且这一相互作用是由UL42双分型NLS介导的。经体外入核转运试验证实,UL42的核定位是一个温度、能量和受体依赖的过程,需要Impα和Impβ同时参与,表明UL42是经Impα/β通路入核的。当缺失NLS的UL42突变体(UL42ΔNLS)与UL30共表达时,UL42ΔNLS/UL30异源二聚体被完全限制在细胞质中,表明UL30利用UL42 NLS的功能入核。上述结果表明,PRV DNA聚合酶全酶复合体在细胞质中装配完成后,借助于UL42双分型NLS的功能,经Impα/β通路入核。研究表明,PRV UL42能在体外刺激UL30的催化活性,且它是UL30的细胞核协同转运蛋白,能在体外引导UL30入核,因此推测UL42是PRV复制的必需基因。本研究对PRV感染后UL42的表达动力学进行了分析,结果发现UL42是PRV的一个早期基因,在病毒感染后5 h就能检测到。根据UL42序列特征设计了3条特异性si RNAs,经Western blot试验证实它们都能在体外有效地抑制UL42的表达。在哺乳动物细胞中转染si RNAs后感染PRV,结果发现这3条si RNAs能剂量依赖性地抑制病毒感染后UL42的表达,且在下调UL42的表达后,PRV的复制显著降低,表明靶向UL42的RNAi能有效地降低UL42的表达,从而抑制PRV的复制。上述结果表明,UL42是PRV复制的必需基因。综上所述,本研究阐明了PRV DNA聚合酶入核转运的分子机制,证实了UL42是PRV复制的必需基因,对深入理解PRV的复制机制具有重要科学意义。


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