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《中国农业科学院》 2017年
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鸡毒支原体生物被膜相关基因筛选及其LAMPs诱导细胞凋亡的研究

汪洋  
【摘要】:鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)属于支原体目、支原体科、支原体属,是禽类重要病原体之一。鸡毒支原体可感染鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、家雀等多种禽类,主要表现为呼吸道症状。鸡群感染鸡毒支原体后除表现咳嗽、流鼻涕、流泪、啰音、呼吸困难等症状外,还可导致蛋鸡产蛋率下降,种蛋孵化率降低,肉鸡生长发育受阻,饲料转化率降低。该病发病率极高,几乎100%的鸡场都有此病,鸡场一旦感染就很难彻底清除,给养禽业带来巨大的损失。很多病原菌为了适应体内外的环境会形成生物被膜。大量的研究表明,生物被膜的形成与病原菌的免疫逃避和抗药性有关,是影响感染的重要因素。本研究成功构建了鸡毒支原体随机插入转座载体,利用该载体进行了随机突变,建立了随机突变库。并利用该随机突变库成功筛选了12株生物被膜形成突变菌株,并成功定位了10个与之对应的突变基因。支原体存在有一种重要的结构脂质相关膜蛋白(lipid associated membrane proteins,LAMPs),在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。近些年,越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要作用。为探讨LAMPs在鸡毒支原体致病性中的作用,我们也进行了以下研究。1.鸡毒支原体随机转座突变库的构建及生物被膜相关基因的筛选为研究鸡毒支原体中重要蛋白与生物被膜形成的关系。本研究拟构建mini-Tn4001SpGm随机转座插入载体。该转座子具备以下特征:含庆大霉素抗性基因,由螺原体螺旋启动子启动抗性基因的表达;抗性基因两侧为含Inner和Outer的IS256插入重复区;重复区之外为金黄色葡萄球菌转座酶基因。通过对随机缺失株的抗性筛选和基因组PCR方法检测,成功获得了738株随机缺失柱。利用结晶紫染色定量法所构建的738株突变库中的突变株进行生物被膜能力形成检测,共通过3轮筛选出12株生物被膜减少的突变株,其减少率在30-80%之间,又通过gene walking鉴定10个被插入阻断的基因分别为S-adenosylmethionine synthetase、Phosphomannomutase、ABC transporter ATP-binding protein、ABC transporter permease、variable lipoprotein family protein、methionyl-tRNA synthetase、PTS system fructose-specific enzyme EIIABC、 Pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha、enolase和conserved hypothetical membrane protein。这10个基因按功能分括Gene regulation、Cellular processes、Translationfunction、Metabolism和Unknown function。我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究鸡毒支原体生物膜形成的调控机制,研究鸡毒支原体的慢性感染机制奠定了基础。2.鸡毒支原体LAMPs诱导DF1细胞凋亡研究鸡毒支原体存在有一种重要的结构脂质相关膜蛋白(LAMPs),在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要作用。首先建立了鸡毒支原体LAMPs与鸡胚成纤维细胞DF1相互作用的模型,采用MTT法检测LAMPs对细胞生长的抑制率,通过DAPI,TUNEL, AO-EB和Annexin-V-PI检测确定了LAMPs具有诱导DFl细胞凋亡的作用。为了进一步确定LAMPs诱导凋亡的调控机制和途径信号通路,实验证实,LAMPs可以激活DF1细胞中caspase 3的活性,裂解PARP。对其凋亡信号通路的了解,将有助于人们找到合适的药物作用靶标,对鸡毒支原体感染的疾病进行治疗。
【关键词】:鸡毒支原体 生物被膜 随机插入突变 LAMPs 凋亡
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.62
【目录】:
  • 摘要8-10
  • ABSTRACT10-13
  • 第一篇 文献综述13-28
  • 第一章 鸡毒支原体的硏究进展13-18
  • 1 鸡毒支原体概况13-15
  • 2 鸡毒支原体毒力因子15-16
  • 3 鸡毒支原体的防治16-18
  • 第二章 细菌生物被膜相关研究进展18-23
  • 1 生物被膜的组成和结构18
  • 2 体外鉴定生物被膜的方法18-20
  • 3 生物被膜的检测技术20-21
  • 4 生物被膜状态和浮游状态的生物学特性比较21-23
  • 第三章 鸡毒支原体转座突变技术23-28
  • 1 转座子23-24
  • 2 目的基因的敲除24-25
  • 3 报告基因25-26
  • 4 鸡毒支原体随机插入突变的研究意义26-28
  • 第二篇 鸡毒支原体生物被膜相关基因筛选28-60
  • 第四章 鸡毒支原体转座子随机突变载体的构建28-38
  • 1 材料与方法28-32
  • 1.1 菌株与载体28
  • 1.2 仪器28
  • 1.3 试剂28-29
  • 1.3 药敏试验29
  • 1.4 转座突变子mini-Tn4001SpGm的构建29-31
  • 1.5 随机转座载体电转化31
  • 1.6 随机突变株筛选方法31-32
  • 2 结果32-36
  • 2.1 MIC药敏试验32
  • 2.2 随机缺失转座载体的构建32-33
  • 2.3 转座突变载体的构建33-35
  • 2.4 重组子筛选鉴定结果35-36
  • 3 讨论36-38
  • 第五章 生物被膜形成相关基因的筛选及鉴定38-48
  • 1 材料和方法38-39
  • 1.1 菌株38
  • 1.2 试剂38-39
  • 1.3 实验器材39
  • 1.4 引物39
  • 2 实验方法39-42
  • 2.1 生物被膜减少株的筛选39
  • 2.2 生物被膜减少株插入序列的鉴定39-42
  • 3 实验结果42-46
  • 3.1 生物被膜形成能力减少突变株的测定42-43
  • 3.2 生物被膜减少株插入序列的鉴定结果43-46
  • 4 讨论46-48
  • 第六章 鸡毒支原体LAMPS诱导DF1细胞凋亡研究48-60
  • 1 材料和方法48-54
  • 1.1 细胞和菌株48
  • 1.2 主要试剂48
  • 1.3 主要试剂配制48-50
  • 1.4 主要仪器50
  • 1.5 鸡毒支原体诱导凋亡实验方法50-54
  • 1.6 统计学分析54
  • 2 实验结果54-59
  • 2.1 LAMPS与细胞相互作用模型的建立54-55
  • 2.2 LAMPS诱导细胞凋亡55-59
  • 3 讨论59-60
  • 全文总结60-61
  • 参考文献61-65
  • 致谢65

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