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《中国农业科学院》 2017年
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呋虫胺对映体选择性环境行为与毒性差异分子机制

陈增龙  
【摘要】:随着农业生产中新烟碱类手性农药环境投放量日益增大,对世界性有益昆虫蜜蜂和蚯蚓毒性高,给农业环境生物安全带来了严重威胁。开展对映体水平的环境行为和毒性差异机制研究有利于该问题的解决。本论文选取典型新烟碱类手性农药呋虫胺为研究对象,评价了其对典型靶标害虫棉蚜(Aphis gossypii)和绿盲蝽(Apolygus lucorum)的对映体选择性生物活性,以及对重要非靶标生物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的生态毒性,探究了呋虫胺对映体在植物和土壤体系中的对映体选择性环境行为归趋,阐明了其主要降解产物和代谢途径,明确了呋虫胺安全使用的关键控制点。通过分子生物学与生物化学手段揭示了呋虫胺对映体对蜜蜂和蚯蚓的生态毒理差异的分子机制。为呋虫胺的环境风险评估、安全使用和低风险手性单体农药开发提供了理论依据,为解决呋虫胺对蜜蜂、蚯蚓的毒性等科学难题提供了新思路,主要结论如下:第一、通过超临界流体色谱系统对呋虫胺及其代谢物对映体进行手性分离,将中心组合设计模型融入到色质联用方法开发中,系统筛查了手性固定相(包括不同填料、粒径和内径)、流动相(包括不同种类、比例和添加剂)、流速、背压以及柱温对分离参数的影响,明确了自变量间的交互效应与因变量的显著影响因子;结合在线旋光检测器鉴别了呋虫胺及其代谢物对映体旋光构型;并制备了高纯度的S-(+)-呋虫胺和R-(–)-呋虫胺单一对映体,对映体比率均大于99.9%。为快速痕量追踪呋虫胺及其代谢物对映体提供了有效方法,为后续对映体选择性生物活性、生态毒性及其环境行为研究提供了基础材料。第二、通过触杀与胃毒双活性生测模式,评价了呋虫胺对映体对典型靶标害虫棉蚜(Aphis gossypii)和绿盲蝽(Apolygus lucorum)的选择性生物活性,研究表明,S-(+)-呋虫胺与R-(–)-呋虫胺对棉蚜和绿盲蝽的生物活性差异不显著(P0.01),前者分别仅为后者的2.6~3.4和3.0~3.8倍;进一步评价了呋虫胺对映体对非靶标生态指示生物赤子爱胜蚓的选择性急性毒性,毒性分级表明S-(+)-呋虫胺对赤子爱胜蚓为高毒,毒性为R-(–)-呋虫胺的71.5倍,两对映体间的毒性差异达到显著水平(P0.01),即S-(+)-呋虫胺为高毒体。第三、结合茎叶与根部两种吸收途径,通过内标法定量,探究了呋虫胺对映体在两种典型蔬菜设施番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)和羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala DC.)中的选择性环境行为,番茄设施栽培过程中,R-(–)-呋虫胺优先降解,导致S-(+)-呋虫胺相对富集,且选择性代谢产生UF对映体,茎叶吸收途径下表现为(–)-UF优先降解;番茄酱室内加工过程中,呋虫胺未出现明显的选择性降解和代谢,但发现呋虫胺对映体主要残留在果皮中,在初级农产品加工过程中,比如使用番茄皮提取番茄红素,需要考虑副产品的安全性;呋虫胺对映体在羽衣甘蓝中的分布、转化和代谢研究表明,S-(+)-呋虫胺在甘蓝体内的吸收速率、转化速率和转化量要明显快于R-(–)-呋虫胺。两个对映体在相互转化的同时均代谢产生UF和DN磷酸盐,其含量变化受母体代谢生成和自身降解双重生理途径影响,且这种选择性代谢仅发生在甘蓝植株体内,水培营养液中始终未检出。第四、采用有氧与厌氧双培养环境,探究了呋虫胺对映体在我国不同土壤体系的选择性环境行为。中性的砂质土壤中,R-(–)-呋虫胺优先降解导致S-(+)-呋虫胺相对富集,而在酸性和碱性的粉质土壤中降解选择性出现反转,表现为S-(+)-呋虫胺优先降解。呋虫胺对映体选择性降解同时选择性代谢产生UF对映体,其中S-(+)-呋虫胺代谢生成(+)-UF,而R-(–)-呋虫胺代谢生成(–)-UF,代谢过程手性构型未发生变化。不同培养环境、不同土壤类型中UF对映体选择性代谢趋势和代谢量存在明显差异,厌氧培养条件下的代谢量显著高于有氧培养条件,说明厌氧土壤中微生物对呋虫胺对映体的代谢影响显著。无论何种培养方式和土壤类型,呋虫胺对映体始终未发生转化,手性构型稳定。第五、从分子水平上阐明了呋虫胺对映体对意大利蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)的致毒机理及其选择性差异机制。将双电极电压钳系统与分子对接技术贯穿到呋虫胺对映体对意大利蜜蜂的选择性生态毒理研究中,进一步证实S-(+)-呋虫胺为高毒体基础上,指出呋虫胺对映体的选择性差异源自意大利蜜蜂烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的α8亚基;通过同源模建与分子对接分析指出,S-(+)-呋虫胺中-NO_2与靶标受体亚基B链精氨酸173残基间发现额外的三重氢键作用力,多重氢键作用网络能够进一步增加S-(+)-呋虫胺与α8功能位点有效结合的稳定性,进而使S-(+)-呋虫胺以一种优势构型对意大利蜜蜂产生更高的毒性。第六、从蛋白水平上阐明了呋虫胺对映体对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的致毒机理及其选择性差异机制。通过探究呋虫胺对映体对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)抗氧化系统影响,及其对乙酰胆碱酯酶(AChE)相关关键调控基因分子表达量分析发现,相比R-(–)-呋虫胺,S-(+)-呋虫胺对乙酰胆碱酯酶(AChE)和典型的抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)、重要的解毒酶(GST和CarE)以及典型氧化还原产物(MDA)的影响大且表现出优先的激活或抑制效应,一方面能够加快神经递质的水解,中断乙酰胆碱在突触中的传递并阻止与乙酰胆碱受体(nAChRs)的结合;另一方面胁迫产生大活性氧自由基导致抗氧化防御系统损伤,进而对蚯蚓产生高毒;进一步发现S-(+)-呋虫胺相比R-(–)-呋虫胺更能显著抑制赤子爱胜蚓乙酰胆碱酯酶(AChE)相关的信号转导基因(EW1_F1P07_H02)和Acyl携带蛋白基因(EW1_F1P04_C04)的上调表达,对其信号转导和GABA受体转运功能产生障碍;能通过显著上调氨基己糖苷酶基因(EW1_F2P14_D06),加快水解N-乙酰氨基半乳糖,使得GM2神经节苷脂转化为GM3神经节苷脂,阻断细胞间通讯;抑制携带蛋白基因(EW1_F1P10_E08)和Ca~(2+)-ATPase通道基因(Lr_PAHCF_64C08_Skplus),进而抑制蚯蚓体内钙离子的主动运输,干扰相关信号转导,导致神经功能障碍从而产生神经毒性。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ450.2

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