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《中国农业科学院》 2017年
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蜜蜂工蜂和雄蜂胚胎期发育蛋白质组及磷酸化蛋白质组研究

房宇  
【摘要】:在蜜蜂社会里,工蜂和雄蜂是对蜂群社会组织和种群繁衍具有重要贡献的两个级型。工蜂和雄蜂分别是二倍体和单倍体,二者在遗传上的差异决定了其生理发育和社会行为存在诸多生物学不同。胚胎发育期是蜜蜂生命周期中的关键时期,成年蜂的各种器官雏形都在胚胎期形成。虽然利用基于双向电泳(2-DE)的蛋白质组学技术对工蜂和雄蜂胚胎期发育的分子基础进行初步探索,但只鉴定到105个蛋白质,仅覆盖了7%的蜜蜂蛋白质组(15323个蛋白质),这在一定程度上限制了对胚胎发育分子基础的客观认识。随着质谱分辨率、灵敏度和精确度技术的快速发展,其蛋白质鉴定能力至少是2-DE蛋白质组的20倍以上。蛋白质组覆盖深度对全面深入解析蜜蜂胚胎发育分子基础至关重要。磷酸化是最为重要的蛋白质翻译后修饰之一,对蛋白质功能具有重要调节作用,已被广泛应用到生命科学研究的各个领域。但利用基于高分辨质谱的蛋白质组和磷酸化蛋白质组技术对工蜂和雄蜂胚胎发育分子基础的研究还尚未进行。本研究利用基于高分辨质谱为主的shotgun蛋白质组学研究方法、非标定量技术、IMAC(固相金属离子亲和色谱)和TiO_2磷酸化蛋白富集等技术以及蛋白质相互作用、激酶预测等生物信息学分析手段,对意大利蜜蜂(意蜂)工蜂和雄蜂的胚胎期蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行系统分析,以期探明调控蜜蜂胚胎发育的关键代谢通路、蛋白质和激酶,为蜜蜂胚胎发育生物学和对胚胎发育机理的进一步研究提供了理论和实践依据。在意蜂工蜂和雄蜂胚胎期,共鉴定3443个蛋白质,与2-DE的胚胎蛋白质相比,鉴定蛋白质的覆盖率提高了30倍以上。尽管蜜蜂胚胎在3个发育阶段的蛋白质表达特点差异很大,但是一个核心蛋白质组主要参与蛋白质合成、能量代谢、发育和转运相关的代谢通路对胚胎发育发挥基本的保障功能。1日龄是胚胎发育的准备阶段,主要功能是提供营养和子核分裂,因此胚胎表达和上调表达的蛋白质主要与营养储存和核酸代谢相关,从而保证胚胎细胞对营养的需求和细胞增殖对核酸的需求;2-3日龄是器官形成的关键时期,器官系统在46hr以后逐步形成的,此时高表达及上调表达的蛋白主要参与细胞周期、抗氧化、细胞骨架以及组织形态发生等活动,为胚胎组织和器官雏形构建提供的细胞代谢保障和分子材料。工蜂和雄蜂胚胎发育基本都在3天完成,但雄蜂为了应对自身体型大的发育需求,形成了不同于工蜂胚胎发育的策略。雄蜂的胚胎器官形成相关的代谢通路较工蜂启动早且持续时间长,以积累足够的构建器官雏形的分子材料。另外,雄蜂的细胞骨架系统、抗氧化系统功能的加强以满足胚胎发育的生理需求。为了探索对胚胎的基因改造,RNAi的初步结果表明在胚胎发育的前48小时对基因进行沉默的效果较好。应用IMAC和TiO_2两种技术优点互补的磷酸化肽段的富集方法,对工蜂和雄蜂胚胎发育进行的磷酸化蛋白质组分析和激酶预测,鉴定到的2438个胚胎蛋白质的6342个肽段上的6577个位点发生了磷酸化修饰,预测了91个激酶,这是迄今覆盖度最深的蜜蜂胚胎磷酸化蛋白质组研究。在蜜蜂胚胎发育过程中,磷酸化对转录、组织形态发生、细胞周期调控/凋亡、细胞骨架和信号转导相关通路具有重要调控作用,相应CDK、MAPK、RSK激酶的持续表达促进了细胞分裂、蛋白质合成、组织分化等生命活动的进行。工蜂和雄蜂胚胎发育早期通过一系列PKA激酶调控能量代谢、信号传导和组织分化,为细胞增殖和胚盘形成提供物质和能量。胚胎发育中后期DYRK和CDK亚家族的激酶调控基因转录、蛋白质合成和胚层分化等代谢活动,foxO和wnt等通路的激活对细胞抗氧化应激、胚层分化、器官形成和背索闭合等过程的完成起决定性作用。磷酸化修饰对工蜂和雄蜂胚胎发育调控也存在显著差异。胚胎发育早期,工蜂mnb激酶对细胞增殖的负调控以及MAPK3激酶磷酸化的T564位点对基因转录和细胞骨架进程的抑制作用,使工蜂胚胎发育未被激活,处于初级发育阶段。而此时雄蜂胚胎CDK12激酶的充分激活促进了转录进程,进而被激活的RNA转运通路送至核糖体进行翻译,雄蜂已开始大量合成蛋白质。胚胎发育中期,工蜂胚胎CDK1激酶在Y15位点上的磷酸化造成激酶失活,制约了有丝分裂等细胞周期的进行,raf激酶的高度磷酸化限制了与胚胎体轴形成、原肠胚及成虫盘相关信号通路的激活,而雄蜂DCAMKL激酶的高活性和wnt信号通路的激活全面推进了大脑等组织器官的形成。胚胎发育后期,工蜂胚胎激活的foxO通路为胚胎提供能量和抗氧化保护,notch、hippo、wnt和hedgehog通路的激活以及CDK9、CDK12和mnb的活性增加和SLK的高磷酸化,推动了细胞生长、转录、翻译和各种器官构建等生命活动的进行。而雄蜂Abl上S637的磷酸化对细胞骨架组织、表皮神经分化、细胞迁移和细胞周期的负调控作用,以及与高活性myo3激酶相关的胚动和背索闭合活动,表明雄蜂胚胎的器官雏形基本完成,处于胚胎的完善阶段。本研究不仅对工蜂和雄蜂胚胎发育期的分子基础有了全新的认识和理解,而且还阐明了二者胚胎发育分子基础的差异。研究发现调控胚胎发育的关键代谢通路、蛋白和激酶、蛋白质亚细胞器和染色体定位信息不仅对蜜蜂胚胎发育生物学,而且为进一步研究胚胎发育机理提供了理论和实践依据。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S891

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