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《中国农业科学院》 2017年
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中红侧沟茧蜂触角化学识别相关基因鉴定及表达特征分析

王山宁  
【摘要】:中红侧沟茧蜂Microplitis mediator(Haliday)属膜翅目,茧蜂科。该蜂是棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)和粘虫Mythimna separata(Walker)主要的寄生性天敌,同时也可寄生夜蛾科其他昆虫,寄主范围多达40余种,是控制害虫种群密度的重要自然因子。目前,在我国已实现该蜂的大量繁殖,并通过人工释放用于田间棉铃虫等重要害虫的生物防治。研究证明,寄生蜂的化学识别在寄主定位中具有举足轻重的作用,而寄生蜂在复杂的化学环境中成功找到合适寄主又是其控制害虫、繁衍种群的首要条件。针对中红侧沟茧蜂化学识别机制开展深入研究,可以帮助我们通过调控寄生蜂化学识别行为,提高田间寄生效率,从而使中红侧沟茧蜂在害虫生物防治中发挥更大的作用。本文对中红侧沟茧蜂触角的化学感器类型及结构特征进行研究,通过二代转录组测序技术结合生物信息学分析,从该蜂触角中鉴定了大量参与化学识别的受体基因,并对嗅觉受体(IRs和ORs)及气味结合蛋白OBPs在触角中的表达模式进行研究。主要结果如下:中红侧沟茧蜂雌雄蜂触角分为柄节、梗节和鞭节三部分。鞭节由16个亚节组成,雄虫触角鞭节明显长于雌虫触角鞭节。扫描电镜结果显示,触角表面分布8种不同形态的感器,包括:毛形感器、刺形感器、板形感器、锥形感器类型Ⅰ、锥形感器类型Ⅱ、锥形感器类型Ⅲ、腔锥形感器和钟形感器。其中,板形感器和锥形感器类型Ⅱ表面具有微孔,感器腔内分布大量神经元树突,为嗅觉感受器;锥形感器类型Ⅰ和类型Ⅲ表面未发现微孔,顶端具有明显的孔状结构,为味觉感受器,其中锥形感器类型Ⅲ仅分布在雌虫触角表面。采用Life Technologies公司研发的Ion Proton?基因测序仪对中红侧沟茧蜂触角转录组进行测序,共鉴定60个气味受体(Mmed ORs)、6个离子型受体(Mmed IRs)和2个味觉受体(Mmed GRs)。利用RACE-PCR技术获得40个ORs、6个IRs和2个GRs的全长序列。RT-PCR结果显示Mmed OR24,Mmed OR26,Mmed OR28,Mmed OR29,Mmed OR31,Mmed OR32,Mmed OR34,Mmed OR36-OR43,Mmed OR45,Mmed OR46,Mmed OR48,Mmed OR49,Mmed OR50,Mmed OR52和Mmed OR53在雌虫和雄虫触角中特异性表达,表明这些基因在寄生蜂触角嗅觉识别中发挥重要作用。6个IR基因和2个GR基因几乎在所有检测组织中均有分布。q RT-PCR结果显示25个OR基因(Mmed OR15,16,18,20,21,22,23,24,25,29,30,31,33,34,35,36,37,41,43,45,47,48,49,50和52)在雌触角表达水平高于雄触角,表明这些基因在雌蜂寻找寄主过程中发挥重要作用。Mmed OR19和Mmed OR26在雄触角的表达高于雌触角,暗示这两个基因可能参与雄蜂对雌蜂性信息素的识别。味觉受体Mmed GR64f在雌触角高表达,可能参与雌蜂触角味觉识别。6个IR基因均在触角中高表达,Mmed IR8a,Mmed IR25a.1,Mmed IR25a.2,Mmed IR64a和Mmed IR76b在雌触角的表达水平高于雄触角,表明这5个IR基因可能在雌蜂寄主识别中发挥重要作用。利用Illumina Hi Seq2500对中红侧沟茧触角转录组进行重测序,共鉴定17个IR基因,其中11个为新基因。进化分析表明10个IR基因编码“antennal IRs”7个IR基因编码“divergent IRs”。基因结构分析表明,触角表达的IR25a同源基因,Mmed IR25a.1和Mmed IR25a.2,为串联重复基因。组织及发育阶段特异性检测(RT-PCR),发现IR基因具有广泛的表达特征,在成虫不同组织、幼虫和蛹期均有表达。定量分析(q RT-PCR)结果显示,多数IR基因在成虫触角表达水平高于身体,表明IR基因家族参与寄生蜂触角化学识别功能。荧光免疫组织化学方法对IR基因共表达受体Mmed IR8a在触角中的细胞定位进行研究,结果表明Mmed IR8a在嗅觉神经元的细胞体和树突膜表达,轴突未发现表达,此外表达Mmed IR8a的神经元树突末端延伸至板形感器内部,表明在寄生蜂触角中IR基因可能分布在板形感器。中红侧沟茧蜂Hi Seq2500触角转录组数据库分析,新鉴定107个Mmed ORs,结合之前实验结果,表明中红侧沟茧蜂触角表达169个Mmed ORs。系统发育分析将Mmed ORs划分为不同亚家族,亚家族中的多数Mmed ORs与毁侧沟茧蜂的Microplitis demolitor ORs具有高的序列一致性(70%),表明OR基因在两种寄生蜂中具有保守的功能。对OR“R”亚家族中的6个成员(Mmed OR98,124,125,126,131和155)基因结构进行分析,表明这6个OR基因具有相似的基因结构,每个基因均由7个外显子和6个内含子组成,并且相同位置的外显子大小相似。基因组中,这6个OR基因衔接排列,形成了明显的OR基因簇,并且基因的编码区具有相同的转录方向,相邻基因之间具有短的基因间距。RACE-PCR和RT-PCR对OR基因簇成员的转录特征进行分析,发现基因簇成员之间独立转录,此外在基因组中相邻的Mmed OR124和Mmed OR98部分转录为双顺反子m RNA(bicistronic m RNA,bm RNA)。原位杂结果表明,以上6个OR基因在雌虫触角中表达的细胞数目不同。通过与嗅觉共表达受体Orco的共表达分析,证明Mmed OR基因表达的细胞类型为嗅觉神经元。双色荧光原位杂交对Mmed OR124和Mmed OR98进行共定位研究,发现尽管这两个基因通过RT-PCR检测到共转录,然而,在雌虫触角神经细胞中未发现两者共表达,表明在触角中这两个基因主要转录为独立的m RNA,并且在不同的神经细胞表达。利用原位杂交技术,对中红侧沟茧蜂18个OBP基因在雌雄蜂触角的表达分布进行研究。雌雄触角共检测到11个OBP基因的表达(Mmed OBP1~8,14,18和19)。剩余7个基因(Mmed OBP11~13,15~17和20)在雌虫和雄虫触角均未检测到,推测可能由于这些基因表达量较低,超出原位杂交检测的阈值。对触角组织切片中OBP探针标记的细胞分布位置进行分析,发现10个OBP基因探针标记的细胞分布在触角感器下方。其中,Mmed OBP2、Mmed OBP6和Mmed OBP7分布在雌蜂和雄蜂板形感器下方,Mmed OBP14仅在雄蜂板形感器下方表达;Mmed OBP18和Mmed OBP1分别在雌蜂和雄蜂锥形感器类型Ⅰ和类型Ⅱ下方表达;Mmed OBP3在雄蜂锥形感器类型Ⅰ、雌蜂锥形感器类型Ⅰ和类型Ⅲ下方表达;Mmed OBP4和Mmed OBP5在雌蜂锥形感器类型Ⅲ下方表达;OBP8在雌蜂和雄蜂腔锥形感器下方表达。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S476.3

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