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芳香族污染物降解菌YC-RL1的趋化特性及降解基因bphC的功能研究

乔铖  
【摘要】:从长期受芳香族化合物污染的活性淤泥中分离筛选到一株以该类物质为碳源和能源的高效降解菌,经鉴定其为节杆菌属(Arthrobacter sp.)细菌,并命名为YC-RL1。经本实验室前期大量研究证明,该菌株具有广泛的底物谱,可实现对大多数芳香族化合物如苯酚类和多氯联苯等的生物降解。微生物的趋化性系统可以使其游向或游离某类化合物,从而实现对该类物质的降解或避免其对菌体的毒害作用以使自身得以更好的生长。为更好的理解实验菌株YC-RL1的趋化性在对底物降解过程中的作用,以对硝基苯酚为趋化物,通过平板趋化性、土壤趋化性以及毛细管趋化性实验等对该菌株的趋化特性进行了研究;同时,通过模拟土壤原位修复作用探究了菌株在实际应用中的效果。高效液相色谱检测结果显示,菌株YC-RL1可在72 h内降解约99%以上的对硝基苯酚。一系列趋化性实验结果表明,菌株YC-RL1在以对硝基苯酚为底物时具有明显的趋化特性,而且当对硝基苯酚浓度在一定范围内(5~800 mg/L)时,菌株的趋化性与对硝基苯酚浓度呈正相关,当其高于800 mg/L时,菌株的趋化特性则逐渐受到抑制。土壤原位修复模拟结果显示,未灭菌土壤中对硝基苯酚的降解速率高于灭菌后土壤中的降解速率,在14 d内其降解率可达95%。研究表明,该菌株对环境具有良好的适应性,在对污染环境的修复过程中也具有重要的应用价值与潜力。进一步通过对Arthrobacter sp.YC-RL1中多氯联苯降解关键基因bphC的克隆与原核表达,鉴定了其编码的2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC的酶活特性与功能。以菌株YC-RL1全基因组为模板通过PCR扩增bphC基因全长,并构建表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后进行原核表达;根据亲和层析原理对重组蛋白进行纯化并分别测定该酶在不同条件下对底物2,3-DHBP的催化特性,确定其最适反应pH与温度以及不同金属离子对酶活特性的影响,并根据拟合的米氏方程对该酶的动力学参数进行分析。结果显示,bphC基因表达所得重组蛋白经纯化后仍具有体外活性,其最适pH与温度分别为pH 7.4和30°C,且部分金属离子如Fe~(2+),Cu~(2+)以及Cd~(2+)等均可促进BphC酶活。经计算,该酶的酶促动力学常数分别为K_m:8.67 mmol/L;V_(max):27.32μmol/s;k_(cat):15.55 s~(-1);k_(cat)/K_m:1.79 mmol/s,同时利用bphC编码的氨基酸序列分析及3D结构预测和分子对接模拟对该酶的特性进行了研究,结果表明BphC酶对底物2,3-DHBP具有较高的亲和性与酶解作用。研究表明,菌株YC-RL1不仅在对芳香族化合物的生物降解过程中具有良好的环境适应性,而且对于该类污染物的生物降解也发挥了至关重要的作用,该菌株在环境修复作用中具有良好的应用价值和潜力。


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