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伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础

武吉强  
【摘要】:自2011年以来,我国许多伪狂犬病疫苗免疫猪场发生了由伪狂犬病毒变异毒株引起的伪狂犬病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。对于伪狂犬病病毒变异毒株的攻击,Bartha-K61等传统的疫苗已经无法为免疫猪提供完全的保护。2012年,本课题组从江苏省疑似发生伪狂犬病的仔猪中,分离到了一株伪狂犬病病毒变异毒株(JS-2012株)。在40℃条件下,把该变异毒株在Vero细胞上连续传代培养120代,获得了一株毒力减弱的伪狂犬病病毒(JS-2012-F120株)。与变异毒株JS-2012相比,JS-2012-F120接种仔猪不引起任何临床症状,而且其相关生物学特性,如蚀斑大小和病毒滴度也发生了改变。本研究通过蚀斑实验,病毒生长曲线以及小鼠感染实验研究了各个代次病毒(第25、45、50、71、91、110和120代病毒)的生物学特性。结果表明,随着传代次数的增加,病毒滴度呈现出逐渐增高的趋势。第120代病毒(JS-2012-F120株)病毒滴度可以达到10~(9.0 )TCID50/ml,明显高于母源毒株(JS-2012株)的滴度(10~(7.0) TCID50/ml)。另外,第50代病毒(JS-2012-F50株)的蚀斑大小只有母源毒株(JS-2012株)50%,而第120代病毒(JS-2012-F120株)的蚀斑大小达到母源毒株(JS-2012株)的95%。此外,随着传代次数的增加,病毒对小鼠的致病力也逐渐减弱。变异毒株(JS-2012株)接种组小鼠的发病率和死亡率分别为100%和50%,而第120代病毒(JS-2012-F120株)接种组小鼠发病率只有30%,并且没有小鼠死亡。为了探索伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础,本研究通过高通量测序并结合常规测序方法获得了不同代次病毒(第25、45、50、71、91、110和120代病毒)的基因编码区(CDS)序列。序列比对分析结果显示,与变异毒株JS-2012相比,第120代病毒JS-2012-F120在gE gI基因区域,有2307个碱基缺失;在IE180,UL18,UL44和UL50蛋白上有4个氨基酸突变,并且在UL16和UL46基因均存在+1位移码突变。UL16基因的952位有1个胞嘧啶(C)核苷酸插入,导致C端有13个氨基酸突变;UL46基因的1796位有29个碱基插入,导致C端有130个氨基酸突变。gE-US2基因区域2307个碱基的缺失可能是毒力减弱和蚀斑减小的主要因素;此外,UL16和UL46基因移码突变可能与毒力减弱相关;gC蛋白的点突变(G90D)可能增强了病毒在细胞间的传播能力。上述结果有助于我们更加深入地了解伪狂犬病毒的致病机理及其生长特性。本研究通过3'RACE、Western-blot和IFA实验的方法从转录水平及蛋白水平验证了UL16和UL46基因的移码突变现象。证实该移码突变并未使这两个基因的功能完全丧失,而只是使编码区延长终止,最终导致3’端氨基酸发生了突变。伪狂犬病毒基因组结构极其稳定,病毒发生移码突变现象极为罕见。本研究结果有助于我们更深入地了解伪狂犬病毒UL16和UL46的基因功能。为制备伪狂犬病病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体,将gE蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中进行了表达。用纯化的融合蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,经细胞融合和筛选,获得了4株稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞(2E5,5C3,5B2和6E6)。间接免疫荧光试验(IFA)显示四株单克隆抗体均能与PRV变异株(JS-2012)反应,但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。而Western blot结果显示只有5C3和2E5能与PRV(JS-2012株)gE蛋白反应,而5B2和6E6与gE蛋白不反应。这些gE蛋白单克隆抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究以及建立鉴别诊断方法提供了良好的工具。


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