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《中国农业科学院》 2018年
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FHY3参与植物生物钟核心基因CCA1的表达调控研究

刘扬  
【摘要】:植物在长期自然选择进化过程中产生出近24小时为周期的生物钟(Circadian clock)。生物钟参与调控植物体几乎所有的新陈代谢和生长发育过程。CCA1作为生物钟中央震荡器的关键基因,在凌晨开始被激活,转录水平提高,随后在白天晚些时候和夜晚得到抑制,维持较低的转录水平。研究CCA1的表达调控分子机理对于阐明整个生物钟的调控机制具有十分重要的意义。1,CCA1基因启动子分析及可能的调控蛋白预测我们首先对CCA1启动子上的顺式作用元件开展了详细的生物信息学分析,发现CCA1启动子上含有FBS(forFHY3/FAR1 binding),ACE(ACGT-containing element),G-box(for HY5 and PIF protein binding)。因此我们推测光信号转导因子FHY3/FAR1,HY5和PIFs蛋白可能直接结合到CCA1基因启动子上。2,光信号转导因子FHY3/FAR1,HY5和PIFs蛋白结合CCA1启动子。我们采用酵母单杂交实验系统,发现FHY3/FAR1,HY5可以体外直接结合CCA1启动子;PIFs蛋白中,PIF3和PIF5可以结合CCA1启动子。进一步我们确定了这些蛋白结合的具体位点:即FHY3/FAR1识别 FBS 位点(gcgcgtg),HY5,PIF3 和 PIF5 识别 Gbox 位点(cacgtg)。另外,我们也采用了凝胶阻滞实验(EMSA)在体外进一步验证了FHY3和HY5是特异的识别并结合CCA1启动子上的FBS和Gbox位点。3,光信号转导因子FHY3/FAR1,HY5和PIFs蛋白对CCA1基因的转录调控。我们发现,FHY3具有激活CCA1转录的能力,而PIF5和TOC1一样,起抑制功能。进一步我们发现,TOC1和PIF5分别可以将FHY3的激活能力降低。此外,我们还分析了CCA 启动子驱动萤光素酶报告基因在fhy3,pifq,PIF50E,PIF30E和FHY3OE中的节律性,该部分结果与我们之前的qPCR结果类似。4,TOC1和PIF5与FHY3/FAR1与蛋白互作并抑制其转录活性。我们研究发现FHY3和TOC1,FHY3和PIF3,FHY3和PIF5在酵母中相互作用。进一步,我们利用双分子荧光互补实验验证了这种相互作用。同时我们也在体内采用CO-IP验证了 FHY3和TOC1,FHY3和PIF5的互作。此外,我们还利用萤光素酶互补实验,研究了在植物体内,FHY3和PIF5,FHY3和TOC1之间蛋白互作的节律性。根据该部分实验结果,我们认为光信号转导蛋白可以和生物钟关键调控因子TOC1相互作用,形成蛋白复合体,结合在CCA1启动子上,协同调控CCA1的转录。5,生物钟控制FHY3和PIF5对CCA1的调控CCA1转录水平受光信号的诱导,我们研究发现,光信号激活CCA1是受生物钟控制的,进一步的研究发现,FHY3和PIF5参与其中。FHY3激活,PIF5抑制CCA1也是受生物钟控制的,经过分析发现,FHY3在凌晨的时候激活CCA1的能力最强,PIF5在早晨抑制活性最高。综上所述,FHY3和PIF5可以直接结合CCA1启动子,分别激活和抑制CCA1的转录。PIF5和TOC1可以直接与FHY3互作并抑制其转录活性。FHY3,PIF5和TOC1的蛋白表达模式,相互作用模式,以及激活和结合CCA1启动子的情况都是受生物钟控制的,从而导致了 CCA1转录水平在后半夜上升并到达顶点。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2

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