伪狂犬病病毒遗传变异及UL41和UL24基因功能分析

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR),又称Aujeszky氏病,是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以母猪出现繁殖障碍,仔猪出现呼吸和神经症状为特征的一种急性传染病。长期以来,我国的养猪场采用弱毒疫苗免疫接种,使该病得到了有效控制。但2011年以来,我国多个免疫过Bartha-K61疫苗的规模化猪场相继出现了变异PRV疫情,造成母猪流产和仔猪死亡率升高,给养猪业造成了巨大经济损失。然而当前流行的变异毒株与经典毒株间的遗传差异以及变异毒株的重要毒力基因的特性与功能尚不清楚。在本研究中,我们对一株国内经典PRV SC株和一株变异HLJ8株进行了全基因组的测序,获得了两株病毒的全基因组序列信息。通过与数据库现有的PRV全基因组序列和PRV gC基因序列一起进行基因组比对和系统进化分析,我们证明来自不同地理区域的PRV毒株表现出不同的进化趋势,特别是我国的早期分离株和当前的变异株组成了新的基因亚型。此外通过重组和系统发育分析,我们首次报道了发生在PRV毒株之间的重组事件,并表明SC株是国内PRV早期毒株和Bartha疫苗样毒株的自然重组株。UL41是α疱疹病毒的保守蛋白,单纯疱疹病毒Ⅰ型的研究表明其具有RNase活性,是病毒感染时重要的调控蛋白。为研究PRV UL41在病毒致病过程中的功能,本文利用体外同源重组技术将UL41上下游序列和eGFP序列连接到线性载体上获得供体质粒。将质粒连同PRV基因组共转染到Vero细胞中,通过筛选产生荧光病变的病毒获得△UL41 eGFP PRV;然后构建只包含UL41上下游序列的供体质粒及包含UL41编码框和HA标签的供体质粒,同时构建剪切eGFP序列的CRISPR/Cas9质粒,一并与△UL41 eGFP PRV基因组共转染Vero,通过细胞病变荧光的有无及PCR筛选得到UL41缺失和回复型PRV。UL41缺失后PRV在Vero细胞上的病毒蚀斑和滴度均比亲本显著减小,表明缺失病毒的复制和扩散能力下降;但在PK-15和MDBK细胞上的滴度与亲本类似,表明UL41缺失只能导致病毒在特异的细胞系中复制能力受损。而且UL41缺失使病毒对小鼠的致死率和神经侵袭能力均显著下降。荧光素酶报告实验表明SC株和JS-2012株UL41的宿主关闭活性有差异,SC株的UL41有更显著的活性。进一步qRT-PCR表明UL41缺失与否,PRV变异株都能使宿主基因表达下降,表明病毒其他因子可能参与对宿主早期的关闭。PRV的UL24同源基因在疱疹病毒中也很保守。其他α疱疹病毒的研究表明UL24是重要的毒力决定因子,而目前还未见对PRV UL24基因的研究。本研究对PRV UL24基因的特性与功能进行了研究。首先UL24基因的mRNA在PRV感染细胞8 h后才能被检测到,同时PAA能显著抑制其转录,表明UL24是PRV的晚期基因。进一步UL24蛋白在病毒感染12 h时被检测到,表明UL24基因可以编码蛋白从而发挥功能。异源表达的UL24可以定位到细胞核中,提示其可能在病毒感染时入核。此外本文利用CRISPR/Cas9技术构建了UL24缺失、TK缺失及UL24和TK双缺失的PRVs。TK或UL24缺失毒株均能在Vero细胞上复制,但在复制晚期各缺失株的病毒毒价会显著低于亲本,各缺失病毒蚀斑也显著小于亲本。体内特性分析表明UL24缺失会导致病毒对小鼠的致病力减弱;而TK缺失后病毒对小鼠丧失致病性。而且在TK缺失株感染小鼠三叉神经没有感染性病毒,但是有病毒基因组存在,表明TK缺失病毒可以侵入三叉神经但是丧失感染能力。此外UL24缺失病毒感染细胞IFN-β的表达量显著升高,表明UL24蛋白能够参与抑制IFN-β表达。荧光素酶报告实验表明UL24蛋白能够通过抑制cGAS-STING激活的NF-κB途径来对IFN-β表达进行调控。不过,UL24调控IFN-β表达的深入机制还需要进一步的研究来证明。综上所述,本研究通过全基因组水平的测序与比较分析发现国内经典PRV SC株基因组的部分序列与Bartha高度同源,表明其是国内株与Bartha疫苗株的潜在重组株。通过对病毒毒力相关蛋白UL41和UL24特性进行研究发现UL41缺失使PRV在体内外的复制和感染力均下降,而且变异株的UL41蛋白由于存在氨基酸的突变,其vhs活性较经典株显著减弱;而UL24缺失能使PRV在体内外的复制和感染力均降低,而且UL24蛋白能够抑制cGAS-STING激活的NF-κB途径对IFN-β表达进行调控。