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应用CRISPR/Cas9技术抑制伪狂犬病病毒的再激活

向广韬  
【摘要】:伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病。PRV是一种嗜神经性病毒,感染猪只后,可在其体内建立潜伏感染。疫苗在该病的防控中发挥了重要的作用,但是现有疫苗不能够阻止潜伏感染的建立与再激活,而且血清学方法不能够检测到处于潜伏感染状态的PRV。在一定条件下,潜伏状态的PRV可以被重新激活,从而导致排毒并引发疫情,这非常不利于PR的防控及根除。因此,研制一种能够清除潜伏感染状态PRV的方法极为必要。本研究首先利用同源重组的方法构建了一株重组报告病毒rPRVTJ-US9-EGFP,经荧光观察、PCR和一步生长曲线鉴定,获得了一株能稳定表达绿色荧光、且生长特性与亲本病毒一致的报告病毒。我们通过分离新生鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)获取感觉神经细胞,并以抗βⅢ-tubulin抗体利用间接免疫荧光试验对神经细胞进行了鉴定。为了获得纯净的感觉神经细胞,我们利用抑制有丝分裂的药物阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-C)对非神经细胞进行处理,并对其浓度进行了筛选。结果表明,5μM Ara-C为最适处理浓度。同时研究了抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对神经细胞的毒性,结果表明0.1~0.7mM的ACV对神经细胞生长没有明显影响。我们利用报告病毒在神经细胞上构建潜伏模型,3个感染复数(Multiplicity of infection,MOI)和5个ACV处理浓度以棋盘滴定法进行试验。结果显示,以MOI=0.001感染感觉神经元,0.5 mM ACV处理7 d后,被感染细胞中的荧光消失,说明可能建立潜伏感染。随后,我们收集PRV的潜伏感染样品和裂解样品,对病毒基因组拷贝数、上清中病毒滴度和病毒各时期基因的表达进行了鉴定,结果表明荧光消失时细胞中存在病毒基因组但病毒不能复制、不产生感染性病毒粒子,确实处于潜伏感染状态。当用10μM的在激活药物LY294002刺激时,潜伏感染的PRV可被再激活进入裂解感染状态。然后我们选取了对PRV复制、再激活有影响的病毒基因UL9、UL42、UL54和VP16。构建含有靶基因的真核表达载体,以蛋白表达的方式初步筛选了sgRNA的编辑效果。结果表明,UL9-sgRNA1、UL9-sgRNA3、UL54-sgRNA1、UL54-sgRNA2和UL54-sgRNA3均可明显降低靶基因的蛋白表达水平。并构建了一系列含有Cas9组件和可能影响PRV再激活的sgRNA的重组慢病毒;最后在潜伏感染模型上评价了重组慢病毒对PRV再激活的抑制效果。携带Cas9组件和针对PRV UL9基因的sgRNA的重组慢病毒能够有效抑制PRV的再激活。本研究为研制兼具清除潜伏感染能力的PR疫苗奠定了基础,也可为其他疱疹病毒潜伏感染的研究提供参考。


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