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《中国农业科学院》 2016年
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milR在米尔贝霉素生物合成中的调控机制

张艳艳  
【摘要】:米尔贝霉素(milbemycin)是由冰城链霉菌产生的一种16元大环内酯类抗生素。现有的研究表明米尔贝霉素具有高效的杀螨,杀虫及抗寄生虫活性,并且对哺乳动物毒性低,对环境无害,这使得其作为植物保护农药和兽药得到了广泛的应用。开展米尔贝霉素生物合成的分子调控研究,在理论上将阐明米尔贝霉素生物合成的调控机制,并为理性提高米尔贝霉素的产量奠定基础。对米尔贝霉素的生物合成基因簇进行分析,发现存在唯一一个LAL家族(Large ATP-binding regulator oftheLuxR family)转录调控基因-milR,推测可能参与米尔贝霉素生物合成的调控。本文研究表明MilR通过直接作用于同一基因簇中milA4-Eorfl和milF这三个转录元启动子区域而正调控米尔贝霉素的生物合成。将milR敲除后,这三个转录元的转录丰度几乎检测不到,同时簇中其它结构基因转录元转录丰度也有一定程度下降,说明MilR能够直接激活milA4-E,orf1和milF的转录,同时间接激活簇中其它结构基因。既然MilR是米尔贝霉素生物合成的关键激活子,于是将单拷贝的milR在冰城链霉菌中进行过表达,结果表明与野生型菌株BC04米尔贝霉素产量2947 mg/l比较,过表达菌株BC04::milR产量高达4069 mg/1,产量提高约38%。MilR过表达能够明显提高产素量,这为米尔贝霉素高产工程菌株的构建提供重要理论指导,使得通过操作调控基因提高抗生素产量成为可能。MilR属于含有ATPase结构域的LAL类的调控蛋白,这类蛋白广泛存在于链霉菌基因组含有Ⅰ型聚酮的次级代谢基因簇中,参与了次级代谢的生物合成调控。定点突变研究表明ATPase结构域中保守的的Walker A和Walker B序列对MilR功能的发挥至关重要。ATPase结构域中Walker A序列富含甘氨酸,为GGPGCGKS,Walker B序列为LVIAVDD,对这两个保守序列分别进行9单个氨基酸替换实验,产素和转录结果表明Walker A中的K37,Walker B中的D122和D123分别突变为Ala后,导致菌株几乎不能产素,并且MilR转录激活功能大幅下降。此外Walker A中四个Gly对MilR功能的发挥影响程度有差别,G31和G32对产素影响较小,但G34和G36影响较大。总体来讲,这两个保守序列中任何一个氨基酸的突变都会导致MilR功能发挥效率降低。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TQ455

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