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《中国农业科学院》 2018年
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基于全基因组测序的黄瓜细菌性流胶病病原菌致病力和比较基因组分析

李磊  
【摘要】:黄瓜细菌性流胶病是黄瓜上的一种重要细菌性病害。近三年来,该病在我国北方多个省份大面积爆发,对当地的黄瓜生产造成了严重的经济损失。前期研究表明,引起黄瓜细菌性流胶病的病原菌主要为两种:一种为扁桃假单胞流泪致病变种(Pseudomonas amygdalipv.lachrymans,Pal),另一种为胡萝卜果胶杆菌巴西亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense,Pcb)。目前,Pal和 Pcb 的研究主要围绕细菌的遗传抗性、抗病育种、基因结构以及快速检测等方面,但从基因组水平对病原菌的致病、侵染以及寄主遗传适应进行系统揭示尚未见报道。此外,在病原菌与黄瓜互作过程中最适内参基因的选择尚缺乏实验数据支持,这为后续开展植物-病原菌互作转录组分析带来了不便。本研究首先测定和筛选了本实验室分离保存的强致病力菌株Pal NM002和PcbSX309,测定了 NM002和SX309的寄主范围;然后利用第三代测序技术和比较基因组分析,系统揭示了NM002和SX309的毒力、侵染和寄主遗传适应相关因子;同时筛选了Pcb侵染黄瓜过程中的最适内参基因。主要研究结果如下:(1)黄瓜细菌性流胶病病原菌致病力及其寄主范围测定研究通过喷雾和针刺接种,对分离于不同地区的14株Pal和14株Pcb进行致病性测定,结果表明Psl-2和HG1501290309在两种接种方式下,均具有强致病力,分别将其命名为PalNM002和Pcb SX309。致病分化研究表明,NM002和SX309能侵染黄瓜、西葫芦等12种蔬菜,表明Paa和Plb具有广泛的寄主范围。(2)扁桃假单胞流泪致病变种NM002全基因组测序及与致病和侵染相关因子分析为了进一步揭示扁桃假单胞流泪致病变种在植物叶部的毒力、侵染和定殖等重要性状,本研究报道了第一株拼接完整的扁桃假单胞流泪致病变种NM002全基因组序列。比较基因组分析表明,NM002与丁香假单胞菌属中三个代表性致病菌的基因组中,鞭毛和趋化性、群体感应系统、双组分系统、脂多糖和抗吞噬作用等毒力相关基因是高度保守的。此外,还揭示了编码III型效应因子、植物毒素(冠菌素、丁香菌素和菜豆毒素)和胞壁降解酶等侵染相关因子的基因差异,这些差异可能与病原菌不同的侵染力相关。(3)胡萝卜果胶杆菌巴西亚种SX309全基因组测序及与致病和寄主遗传适应相关因子分析胞壁降解酶是果胶杆菌属病原菌致病的关键因子。然而,果胶杆菌其它毒力因子及其对宿主的遗传适应机制仍需进一步研究来揭示。本研究报道了胡萝卜果胶杆菌巴西亚种SX309全基因序列,并与分离于不同寄主植物的果胶杆菌属病原菌进行了比较分析。结果表明,大多数毒力基因在果胶菌株中高度保守,特别是参与胞外酶合成的关键毒力因子,以及Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统、群体感应系统、鞭毛和趋化基因等。此外,通过比较分析Ⅵ型分泌系统和两个亚型的CRISPR-Cas系统的差异,推测它们在病原体致病和寄主遗传适应中发挥着重要作用。(4)胡萝卜果胶杆菌巴西亚种SX309侵染黄瓜过程中最适内参的筛选和应用为了更好地揭示黄瓜-Pcb相互作用的分子机制,qRT-PCR是广泛用于检测目的基因表达的高效且灵敏的技术。本研究的目的是利用qRT-PCR鉴定Pcb侵染黄瓜过程中二者稳定的内参基因。我们挑选了 14个黄瓜的候选内参基因,10个Pcb的候选内参基因,采用deltaCt、BestKeeper、NormFinder和geNorm四种算法对在Pcb侵染黄瓜过程中的候选内参基因的表达稳定性进行了评价。结果表明,在Pcb-黄瓜相互作用过程中,CsARF是黄瓜的最佳内参基因,rho是Pcb的最适内参基因。此外,为了评估内参基因的可靠性,我们还测定了参与植物免疫与抗病的CsCAT,CsPR5,CsRPM1,CsBIK1和CsWIPK基因的相对表达量,以及参与Pcb致病的毒力因子luxS,carI,hrcC,peh和lon基因的相对表达水平。本研究系统揭示了 Pal和Pcb的全基因组信息,并筛选了植物与病原菌互作过程中的最适内参基因,可以为更好地研究Pal和Pcb的致病机理及与植物的互作分子机制奠定基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S436.421

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