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《中国农业科学院》 2018年
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奶牛乳腺上皮细胞Sestrin 2基因在氨基酸调控酪蛋白合成中的作用机制

骆超超  
【摘要】:在奶牛乳腺上皮细胞(CMEC)中,氨基酸(AA)是酪蛋白基因表达与翻译的重要调控因子。AA主要通过雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)通路调控酪蛋白合成,但AA调控mTORC1上游通路的调控机制尚不清楚。本研究的目的是确定奶牛乳腺上皮细胞中Sestrin2(SESN2)在氨基酸调控酪蛋白合成中的作用机理,完善氨基酸调控酪蛋白合成的信号通路。SESN2负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成对CMEC进行添加全部AA、添加必需AA和不添加AA处理,用MTT比色法、流式细胞术、蛋白质免疫印记和免疫荧光等方法检测细胞增殖、细胞中酪蛋白、SESN2的表达及mTORC1通路的活化。结果表明,添加AA后,细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORCl通路的活化均显著增加,但SESN2的表达显著下降;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰处理,实验结果表明,Sesn2基因过表达后,细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORC1通路的活化均显著降低,且Sesn2基因过表达能抑制AA诱导的细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORCl通路的活化,反之亦然。这说明,SESN2能抑制AA诱导的细胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化。SESN2通过SH3BP4负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成用免疫共沉淀(Co-IP)、QE质谱等技术鉴定SESN2的相互作用蛋白,结果表明,共鉴定到SESN2的互作蛋白108个,其中包括mTORC1上游通路相关的LAMTOR4、SH3BP4、TSC1等;试验选择SH3区域结合蛋白4(SH3BP4)进行后续研究。对CMEC进行Sh3bp4基因过表达或干扰处理,检测SH3BP4对SESN2调控mTORC1的影响。结果表明,Sh3bp4基因干扰能抑制SESN2过表达对mTORC1的抑制,反之亦然;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰处理,检测SESN2对SH3BP4与Rag GTPase结合的影响。结果表明,SESN2过表达能促进SH3BP4与Rag GTPase的结合,反之亦然。这说明,SESN2通过促进SH3BP4与Rag GTPase结合来抑制mTORC1通路;对CMEC进行Atf4基因过表达或干扰,结果表明,AA缺乏通过ATF4促进SESN2的表达。SESN2通过GNG12负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成用SWATH鉴定CMEC的溶酶体膜蛋白,结果发现GNG12与AA诱导的酪蛋白合成有关;对CMEC进行GngI2基因过表达或干扰,结果表明GNG12能促进AA诱导的细胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化;用Co-IP鉴定GNG12的互作蛋白,结果表明,GNG12能与Ragulator结合;对CMEC进行p18(Ragulator亚基之一)基因过表达或干扰,结果表明,GNG12通过Ragulator调控mTORC1通路;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰,结果表明,SESN2抑制细胞中GNG12的表达及溶酶体定位。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,SESN2是酪蛋白合成的负调控因子。氨基酸缺乏促进ATF4表达,并使其进入细胞核,激活Sesn2的转录,上调SESN2表达,并促进表达的SESN2从两方面抑制mTORC1通路及酪蛋白合成。一是SESN2与SH3BP4结合,促进SH3BP4对Rag GTPase的抑制,从而抑制mTORC1通路的活化及酪蛋白的合成;二是SESN2抑制氨基酸诱导的GNG12的表达及其对Ragu1ator的激活,从而抑制mTORC1通路的激活及酪蛋白的合成。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S823

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