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伪狂犬病病毒UL23基因转录调控机制研究

程雪飞  
【摘要】:猪伪狂犬病,是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)导致的急性传染病,主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪神经症状。伪狂犬病病毒属于α疱疹病毒亚科水痘病毒属,编码70多种蛋白,按表达的时序性可分为立即早期、早期和晚期蛋白。IE180(Immediate Early Protein 180,ICP4)和EP0(Early Protein 0,ICP0)分别为立即早期和早期的主要调控蛋白,主要调控病毒前期蛋白的合成以及组装,同时对病毒复制是必须的。除了这两个蛋白外,UL48(VP16)、UL54(ICP27)和UL41(VHS)也是病毒在增殖过程中重要的反式作用因子。UL23基因是伪狂犬病病毒重要的毒力基因,其编码的蛋白为病毒自身所需的胸苷激酶(Thymidine Kinase,TK),在病毒的核酸代谢中发挥重要作用。缺失TK基因可使病毒高度致弱,对敏感动物不致死,所以一些商用弱毒活疫苗是TK基因缺失的。UL23基因在α疱疹病毒亚科中相对保守,其在级联转录调控机制方面报道很少。本研究通过对UL23基因的转录特点以及病毒蛋白和细胞转录因子对该基因转录调控影响进行研究,以便深入了解UL23基因的转录特性。本研究运用5’RACE技术对PRV JS-2012 UL23基因的5’端进行快速扩增,发现在转录过程中有2条转录本,转录起始位点分别位于CDS区域前30bp和866bp。为了确定两条转录本启动子的关键区域,对转录起始位点前的序列进行不同长度的截取(TSS1 1-1、TSS1 1-2、TSS2 2-1-inr40、TSS2 2-2-inr40、TSS2 2-3-inr40、TSS2 2-4-inr40、TSS2 2-5和TSS2 2-6),利用双荧光素报告系统对不同片段的启动子活性进行检测,结果表明TSS1 1-1和TSS22-1-inr40为两条转录本的启动子。为了确定两条转录本关键的顺式作用元件,对TSS1 1-1和TSS2 2-1-inr40多个顺式作用元件如TATA box和GC box实施多点突变。发现对于TSS1,其主要关键位点位于86-94位的GC box和134-140位的TATA box;对于TSS2,主要关键位点位于169-174位的GC box。本研究构建了PRV转录调控相关反式作用因子的真核表达质粒,以探究其对UL23的基因调控作用。发现IE180、EP0和UL54均对两条转录本的转录活性有直接促进作用。细胞内源性的转录因子PTBP和Sp1过表达,对UL23基因的转录有不同程度的促进作用。病毒反式作用因子和细胞转录因子蛋白互作实验表明:EP0既可以协同Sp1也可以协同PTBP调控UL23基因的转录;IE180可以协同PTBP,UL54可以协同Sp1共同调节UL23基因的转录。为了确定TSS2在UL23基因转录过程中的作用,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了TSS1启动子缺失的病毒。为了检测TK的表达,同时制备了UL23蛋白的鼠多克隆抗体。结果显示,在缺失TSS1之后,间接免疫荧光试验没有检测到TK表达。提示TSS1是UL23基因的关键启动子,TSS1缺失后,TSS2不能代偿TSS1的功能,使TK表达。总之,本研究揭示了PRV UL23基因在转录机制方面的新特点,为PRV核酸代谢以及增殖研究提供一定的理论依据。


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