伪狂犬病病毒潜伏感染相关转录物LLT表达特征的研究

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多种家畜和野生动物的急性、热性传染病,但只有猪是PRV的唯一贮存宿主。伪狂犬病能给养猪业造成极大的经济损失,特别是2011年末以来PRV变异株在我国的爆发流行,严重影响了养猪业的健康发展。与其他疱疹病毒类似,PRV急性感染后能够在宿主体内形成潜伏感染,潜伏感染时期,病毒基因组不复制,也不表达病毒蛋白,仅大量转录病毒潜伏相关转录物(Latency Associated Transcripts,LATs)。然而,长期以来,关于LAT转录特征及调控机制的研究较为缺乏,其转录与调控机制及对病毒感染复制的影响也不清楚。LATs是由大的潜伏相关转录本(Large Latency Transcripts,LLT)分子剪接加工形成的,为了研究PRV LLT两个启动子LAP1和LAP2在其转录调控方面的作用机制,本研究首先构建一系列供体质粒,包括缺失LAP1、缺失LAP1并添加绝缘子cHS4或添加强启动子CMV、同时缺失LAP1/P2等。然后,利用BAC/galK系统将galK基因替换LLT的启动子区域,经正、负筛选后将构建不同质粒的目的基因替换galK基因,经PCR鉴定筛选到不同的阳性克隆,分别提取各个阳性克隆的BAC DNA,并将其与pcDNA3.1-cre质粒共转染至Vero细胞,成功拯救出缺失相关启动子的突变病毒(vJS-△LAP1、vJS-cHS4-△LAP1a、vJS-cHS4-△LAP1b、vJS-CMVp-△LAP1、vJS-△LAP1/P2和vJS-cHS4-△LAP1/P2)。进一步对亲本病毒JS-2012和突变病毒的体外生物学特性进行比较研究,结果显示:突变病毒在空斑大小和形态上都与亲本病毒没有显著差异。病毒一步生长曲线表明,各突变病毒与亲本病毒的复制动力学特征基本一致。进一步,我们对突变病毒的潜伏相关转录本表达特征进行了分析,发现启动子缺失病毒在感染的Vero细胞中存在LLT内部ORF1和ORF2基因的转录,在小鼠脑组织和三叉神经组织也能检测到LLT的表达,表明LLT启动子的缺失并没有造成LLT转录的完全关闭。但LLT启动子缺失使LLT内含子中编码的多种miRNA(miR-2-3’、miR-5和miR-9-3’)分子的转录水平显著降低,表明LLT启动子对该区域的miRNA分子转录存在调控作用,但是LLT启动子调控病毒miRNA分子表达所产生的生物学意义还需要进一步的研究确定。综上所述,本研究利用BAC/galK反向遗传操作系统,以PRV JS-2012作为骨架,获得了一系列LLT启动子LAP1/P2突变的PRV病毒株,通过对各突变病毒株的体内外生物学特性分析,发现LLT启动子突变不能显著影响病毒的体内外生物学特性,也不能关闭LLT内部ORF1和ORF2基因的转录。但是LLT启动子的缺失,会显著下调病毒LLT内含子内部多个miRNA分子的转录。