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《中国农业科学院》 2000年
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H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究

刘明  
【摘要】: 本文根据禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)核蛋白(NP)基因核苷酸序列, 设计合成了NP基因特异的引物NPF/R。不需要经过病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的 气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中用Trizol试剂提取病毒核酸,采用RT-PCR技术可以扩 增出326bp的NP基因片段。采用引物NPF/R对14个亚型禽流感病毒标准参考株,4个亚型 12株国内分离野毒株进行RT-PCR,都能特异的扩增出扩增326bp左右的目的片断,采用地 高辛标记的NP基因探针进行斑点杂交,结果证明了PCR产物的特异性。新城疫病毒、法氏 囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒RT-PCR扩增结果 都呈阴性。禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/African Starling/England/983 /79(H7N1)人工实验感染鸡病料的RT-PCR检测结果与鸡胚病毒分离结果分别为34/42、 32/42;24/55、24/55符合率在95%以上。RT-PCR最少可以检测到10pg的病毒核酸。对 山东某地发病鸡场样品进行RT-PCR检测,只用6个小时就得出确实的诊断结果。 根据Genbank数据库中发表的H5和H7亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)核苷酸序列, 分别设计合成了H5和H7亚型HA基因特异的引物H5F/R和H7F/R,建立了RT-PCR鉴别H5 和H7亚型的分子分型诊断技术。引物H5F/R经RT-PCR能够扩增出H5亚型247bp的目的片 段,引物H7F/R经RT-PCR能够扩增出H7亚型192bp的目的片段,这两对引物对其它亚型 流感病毒和新城疫、传染性支气管炎病毒RT-PCR检测结果均呈阴性。采用地高辛标记的HA 基因探针进行斑点杂交,结果证明了上述PCR产物的特异性。RT-PCR对H5和H7亚型实验 感染鸡病料的检测结果与病毒分离结果分别为H5,32/38、30/38;H7,19/38、21/38的 符合率为95%。使用引物H5FS/RS或H7FS/RS,经RT-PCR分别扩增出H5亚型998bp或H7 亚型712bp的包含裂解位点在内的HA基因片段,目的片段回收后直接用于测序反应,根据 核甘酸序列推出的蛋白质氨基酸序列可以用来判定H5或H7亚型病毒的致病性高低,从而 为H5或H7型禽流感的毒力分析预测提供可靠的实验依据。 分别设计了HA基因和NA基因特异的引物,引物5’端分别添加有BamHI位点和HindIII 位点,经RT-PCR分别扩增了禽流感病毒A/Goose/Guandong/1/96(H5N1)1.7kb的HA基因 和1.4kb的NA基因,BamHI和HindIII酶切,然后分别克隆到pUC19的BamHI位点和HindIII 位点,酶切筛选得到阳性重组子pUCH5和pUCN1。经序列测定后,再将HA基因和NA基因分 别亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB的BamHI位点和HindIII位点中,随机筛选得 刘 明 HS和 H7亚型禽流感病毒分子防制技术的研究 2000年 6月 别亚克隆到杆状病毒转移载体PBlueBacHisB的BalnHI位点和Hindlll位点中,随机筛选得 到重组转移载体pBacHS和pBacNI,序列分析证实读框正确后用于转染实验。从含有 A/African Starling/Ensland/983/79(H7NI)HA基冈的重组质粒pUCH7中用 BamH切下 1.7kb的M基因,然后将其插入杆状病毒转座载体pFaslBacDUAL的 BalnHI位点,随机筛 选酶切鉴定得到止向重组转座于pFASTll7,经序列分析证明HA基因完整,方向正确,然后转 染含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,经抗生素筛选,PCR鉴定得到阳性穿梭转座子rBacmidH7。 在脂质体转染试剂CeellFECTIN介导下,将杆状病毒转移载体pBacHS和pBacNI与线性 化的杆状病毒DNA(Bac-N-Blue DNA)共转染对数生长期的肝 昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑, 经二轮蚀斑纯化,获得重组杆状病毒rBacHS和rBacNI。重组穿梭载体pBacmidH7在脂质 体转染试剂介导卜.转染肝 细胞,获得重组杆状病毒rBacll7。提取重组杆状病毒DNA经 PCR扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、ELISA试验 结果表明 HA和 NA基因在重组杆状病毒感染的蚊 细胞获得表达。SDS-PAGE电泳分析显示 用组杆状病毒表达HA蛋白分子量为60kDa左右,能够凝集公鸡红细胞,血凝价1280—2560 HAU/ml。里组杆状病毒表达M蛋白分子量为 50kDa左右。 页织杆状病毒rBacHS、rBacNI、rBacH7和野生病毒AcMNPV分别感染肚 细胞72小时 后收集细胞,免疫6组6周龄肝P鸡。卜4组,m只/组,m‘细胞/只肌肉注射;对照组1 fU 2,5只/组 10‘细胞/只肌肉注射。rBacHS和 rBacH7,rBacNI免疫组经二次免疫后,每 次间隔时间为2周,rBacHS和rBacNI联合免疫组1&免疫后4周;分别以10’EID。。的 A/Goose,/G。angdong/1/96(HSNI)和A/African Starling/England/983/79(H7N)肌肉接种 10’ EIDS。进行攻毒试验,试验结果表明所有亚单位疫苗免疫组都可产生禽流感病毒亚型特异性 抗体,rBacHS一次免疫即可诱导产生血撤抑制抗体(HI) 3.slooZ,加强免疫后HI抗体效 价明显升高 4.slogZ。rBacHS二次兔疫组和 rBacHS+rBacNI联合免疫组对强毒攻击的保护 率达 90%(9/10),rBdCNI免疫组对强毒攻击保护率为 50%(5/10),而空白对照组对强毒 攻击不能提供保护,5只鸡全
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:S851.3

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前5条
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中国博士学位论文全文数据库 前4条
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前4条
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【二级引证文献】
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3 马雪平;;人禽流感的研究进展[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
4 郑则乐;;禽流感已成为社会关注的问题[A];福建省科协第四届学术年会卫星会议“动物疫病防治与人类健康”学术年会论文集[C];2004年
5 李俊辉;王艳丽;姜永萍;左青山;冉多良;陈化兰;;表达H7亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒的构建及其免疫效力评估[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
6 鲁杏华;谈志祥;卢建红;邱立新;朱中武;;湖南禽流感血清学调查[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年
7 崔尚金;李曦;童光志;;禽流感发生的流行病学分析[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
8 徐小元;;2005~2006年我国20人禽流感病例临床特征分析[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
9 纪素玲;田发益;王洪奎;;西藏某个体养殖场爆发禽流感病的诊断[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年
10 ;禽流感开始攻击人类,世卫组织警告其威胁可能超过非典[A];中国生理学会论文汇编2004年第一期[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王淑军;我国禽流感快速检测技术获突破[N];人民日报;2005年
2 中国农业科学院 孟庆文博士;今年严防禽流感暴发任务艰巨[N];中国畜牧报;2005年
3 小鱼;正视禽流感 不要谈“禽”色变[N];国际商报;2004年
4 张见麟;再谈高致病性禽流感[N];健康报;2005年
5 新华社记者 贺劲松 徐京跃 张旭东;人民的健康高于一切[N];人民日报;2004年
6 李慧竹;全省疫区解除封锁[N];沈阳日报;2005年
7 马永欣;防治禽流感切勿猪禽混养[N];天津日报;2005年
8 丁海霞;对禽流感的理性思考[N];中国医药报;2005年
9 范玉芳 柳占奇;构筑坚实可靠的防疫屏障[N];酒泉日报;2006年
10 记者  苗萌萌;见仁见智禽流感[N];上海金融报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘明;H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究[D];中国农业科学院;2000年
2 杨芳;非政府组织(NGO)参与我国重大传染病控制的治理模式研究[D];华中科技大学;2009年
3 蒋露芳;上海地区人群甲型流感的传播与病毒抗原变异的研究[D];复旦大学;2007年
4 秦美婷;台湾健康传播之研究[D];中国科学技术大学;2006年
5 肖肖;全球化疫病控制中的预警原则与策略[D];南京农业大学;2006年
6 孟庆文;逆转录病毒介导的特异性反义RNA和核酶抑制禽流感病毒复制的研究[D];中国农业科学院;2001年
7 刘鑫;麻疹病毒通过受体SLAM对昆虫细胞的感染及其诱发细胞凋亡的机制研究[D];武汉大学;2005年
8 唐军;FAT10在H5N1病毒及甲型H1N1流感病毒复制及诱导人呼吸道上皮细胞凋亡中的作用[D];北京协和医学院;2013年
9 黄德林;中国畜牧业区域化、规模化及动物疫病损失特征和补贴的实证研究[D];中国农业科学院;2004年
10 王颖;细胞色素P450 2C9酶的结构与催化功能关系的研究[D];吉林大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张芳芳;H5、H7亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的研究[D];甘肃农业大学;2004年
2 李金明;“菌毒克星”对动物免疫增强作用的研究[D];福建农林大学;2004年
3 王懿;肉鸡禽流感免疫程序的研究[D];中国农业大学;2004年
4 贾泽颖;禽流感-H5卵黄免疫球蛋白的制备及其应用[D];中国农业大学;2004年
5 黄得纯;鸭流感的免疫动态研究[D];湖南农业大学;2004年
6 李东燕;高致病性禽流感随进口禽类及其产品传入的风险分析[D];中国农业大学;2005年
7 郝婧;禽流感病毒H7亚型HA优化基因的表达[D];内蒙古农业大学;2006年
8 郭闯;水禽禽流感H5N1亚型超微病理研究及其基质蛋白单克隆抗体的制备与初步应用[D];扬州大学;2004年
9 阮文科;水禽禽流感分离株毒力特性及其HA序列的分析与比较[D];扬州大学;2003年
10 赵青松;宜昌市禽流感的调查与防制对策研究[D];华中农业大学;2004年
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