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《中国农业科学院》 2000年
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Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究

檀建新  
【摘要】: 苏云金芽孢杆茵产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目等多种害虫具有杀虫活 性,几丁质酶对植物真菌病害有防治作用。本文从这两方面入手对苏云金 芽孢杆菌δ-内毒素基因克隆、表达和环状芽孢杆菌几丁质酶进行了研 究。以期为构建具有杀虫和抗病双重活性的工程菌或转基因植物提供科学 依据和有效材料。 1.苏云金芽孢杆菌C005是由湖北Bt中心提供的国内自行分离的对鳞 翅目害虫小菜蛾具高毒力的野生菌株,能产生双锥体晶体。PCR-RFLP 鉴定含有cry1Ab基因。以此菌株为出发菌株,PCR扩增产物为探针, 通过Southern blotting证明质粒的PstI酶切产物中8.5kb处有阳性杂 交带,利用PCR方法筛选转化子,克隆了含cry1Ab全长基因的8.5kb 大片段并测序。该基因编码区为3468bps,Cry1Ab13蛋白含1155个 氨基酸、分子量为130.6kDa,等电点为pH4.845。该基因已在 EMBL/GenBank基因库中注册,Accession number为AF254640,被 国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab13。 2.苏云金芽孢杆菌B-G-8是由东北农业大学提供的国内自行分离的野 生菌株,经PCR—RFLP鉴定B-G-8菌株中含有新的cry1A基因。B-G-8 质粒DNA经Sau3AⅠ部分酶切,回收5~7kb片断与pUCP19连接 并转化大肠杆菌,利用PCR方法筛选转化子,克隆了含cry1A全长 基因的6.9kb大片段并测序。序列同源性分析表明3000bps的编码区 序列与cry1Ac5的同源性最高为82.8%,说明该基因是一新的cry1A 基因。该基因编码区长3549bps,编码1182个氨基酸的蛋白质,蛋白 分子量为134kDa,等电点是pH4.985。现已提交EMBL/GenBank基 因库注册,Accession number为AF281866。 DE < 将含 CrylAbl3的 8.skb的 PSt大片段插入广宿主载体 pGMll05,构 建了含CI’y jAbjJ的重组质粒pGM81,并转化大肠杆菌JM107石, 荧光假单胞菌和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株CryB”,得到转化子分别 是 ETG81-J、ETGS Is,PtTG81和 Bi。tISI,SDS—PAGE电泳证明它 们都表达了Cry1Ab 130石kDa蛋白。电镜观察表明BiotI81有双锥体形 晶体形成。PffG81和 Bi。tI81均表现出杀虫活性。PffG81原液 48小 时使敏感品系的小菜蛾死亡率达 90%,Bi。tISI在 24个时对北京地区 小菜蛾(敏感品系)的LC;。为工35qL/mL,对海南地区小菜蛾(抗性 品系)24刁时的 LC。。为弓.35卜L/mL。4卜L/g浓度的 BiotI81 和 C005对 棉铃虫体重增加的抑制作用分别为 97.7%和 gi二%。 将含有 CryIA基因的大片段插入 E COltst穿梭载体 pHT315,转 化大肠杆菌JM、SCSllo和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株BE20, 也获得了转化子 ETG59-J、ETG59-S和 Bi。tI59,BIOtI59 SDS—PAGE 电泳在70kD处有蛋白带表达。电镜下观察到双锥体形晶体。 Bi。tISI和 Bi。tI59比出发菌株 C005和 B.G.8的生长略慢,蛋白 质表达也相应推迟,但生长趋势一致。 从颐和园等地点采集土样、沙样等共55个,搜集各类细菌228株,在 几丁质平板上用透明圈法筛选得到 4株细菌、12株放线菌,60株 BI 均有较高的几丁质酶活性,其中CT14菌株的几丁质酶活性最高。CT14 菌体形态为长杆状,0.4~0石XI.6~4.8 u m,芽泡膨大中生或近端生, 椭圆形,菌落淡黄色、湿润粘稠,经鉴定 CT为环状芽抱杆菌。 比较了 CT几丁质酶活性测定方法中的影响因素,确定最佳反应条 件是:500 p L反应体系中几丁质酶作用时间20分钟、加入蜗牛酶40 u L(0.ic/mL)、保温 30分钟、力入 0.smol*的 K。B,0,150 u L、DMAB 量至少ZmL,并且须在反应结束后30分钟内测定585urn OD值。 不同碳、氮源对 CT几丁质酶活性影响试验表明:在无几丁质的 培养基中 CTI4的几丁质酶有一定表达,加入几丁质后可以诱导几丁质 酶大量表达:在以几丁质为碳源的含氮源的培养基中,由于无其他单 二 中臼农业科学院博士学位论文 糖抑制,发酵液有较高的几丁质酶活性。 CT几丁质酶在洲~7的缓冲液中能保持较高的稳定性,pH7时 活性最高:几丁质酶在20~40℃条件下保温30分钟仍有较高稳定性, 且在 40℃时几丁质酶活性最高。0.lmol/L Na\ K二 Mg‘\ Ba‘二 Zn‘”Ga‘” Mn‘”,Cu‘”,Ag”,Fe‘“金属离于均不同程度抑制几丁质酶的活性,但 F/。 对几丁质酶有一定激活作用。 6.CTI4几丁质粗酶液经阴离子交换柱层析后产生一个穿透峰(PO)和三 个盐洗脱峰(PI,Pll,Pill),它们都有几丁质酶活性。SDS—PAGE 电泳表明有几丁质酶活性的穿透峰中蛋白质分布在40~50kDa之间, 而盐洗脱峰 PI中蛋白质在 60kDa或 25kDa左右,盐洗脱峰 Pll中的蛋 白质存在于25kDa或20kDa左右,盐洗脱峰Pill中的蛋白质在20kDa 以下。据此推测,CT菌株的几丁质酶可能不只一种。 7.抑菌试验表明:0.sing CTI4几丁质酶粗蛋白,对多种病原真菌生长
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:S476;S188

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