表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究

【摘要】：鸡传染性喉气管炎 （Infection Lnyngotrcheitis Vrus，ILT）是由鸡传染性喉气管 炎病毒（ILTV）引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各国，我国在 50年代发现本病，现己在许多省份流行。目前国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫 茵，但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点：（l）由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关， 因此，现用的疫苗毒力普遍偏强，接种后反应大；（2）与ILTV强毒一样，其弱毒疫 由株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终主带毒；（3）疫苗病毒可以由接种鸡传染 给非接种鸡，在鸡与鸡，鸡群与鸡群之间传插过程中毒力会返强，从而成为新的感染 源；（4）到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。因此，研究新型安全且 有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。 糖蛋白 gB是ILTV的主要保护性抗原，它能诱导机体产生体液和细胞介导的保护 性免疫应答，是该病毒感染复制必需的蛋白。根据已经发表的ILTV SA。疫苗株的gB 基因序列，设计了一对特异性引物，然后通过PCR方法扩增了ILTV中国王岗株的gB 基因，并克隆到PUC质粒的EcORI位点中。序列分析结果表明克隆的PCR片段含 有2619hp核昔酸，包含了完整的gB基因阅读框架。序列比较分析结果显示，ILTV 王岗株（强毒株）的gB基因核昔酸序列与英国的Throne 882株和美国的632株（二 者均为强毒株）的 gB基因核昔酸序列完全一致，而与澳大利亚 SAZ株（弱毒株）的 gB基因核昔酸的同一性为99．8％，氨基酸的同一性为98．4％。三株ILTV强毒和弱毒 比较，弱毒 gB基因在第 89位和第 102位分别发生了一个碱基的插入和缺失，结果导 致5 个氢基酸的移码突变，即由强毒的“川＊－C卜11eJie－＊印”变成弱毒的 “GIy·切－Asn·Asn－Ser。 将克隆到pUCllg中的ILTV糖蛋白gB基因再亚克隆至杆状病毒转移载体 pVL1393中，形成重组质粒甲VLgB。将pVLgB与杆状病毒线性DNA（BAC－N－Blue DNA）共转染Sffi昆虫细胞，经三轮蚀斑纯化，获得重组杆状病毒pVL－ILTVgB。通 过PCR方法鉴定证明gB基因被正确插人到杆状病毒基因组中；直接免疫荧光试验结 果也表明 ILTV gB基因在重组秆状病毒感染的 Sfg昆虫细胞中被表达。表达的糖蛋白 gB作为亚单位疫苗用于下一步的免疫试验。 将克隆在pUCllg中的gB基因和大肠杆菌的L。Z基因分别亚克隆到禽痘病毒转 移质粒中 然后 将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S－FPV－017 t苗株感染的SPF I 张扭杰 双达传贝佐顺气管炎间写怵蠢困且阑禹区们＠的构巨及江免沤戮力研灾 Zboo年6月 鸡胚成纤维细胞中，通过蓝斑筛选出重组鸡痘病毒（rFPV－ILTVgB），并对其进行了 6 轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明，其基因组中含有完整的ILTV gB基 因：“巾悦＊＿．M删实验也证明了该重组病毒在其感染的sPr 4胚成纤维细胞中表达了 ILTV f蛋白gB。 用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种6周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试 验共设立7组（每组】0只鸡）：第1组用商品化V弱毒疫苗点眼免疫：第2组用 rFPV－ILTVgB翅皮下注射免疫；第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射兔疫；第车组 用rFPV－ILTVgB免疫2次，间隔2周；第5组用rFPV－ILTVgB一免，2周后用重组杆 状病毒表达的 ILTV gB蛋白二免；第 6组用含 ILTV gB基因的重组质粒一免，2周后 用 rFPV－ILTVgB二免；第7组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后 4周以致 死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。用重组鸡痘病毒rFPV－ILTVgB等接种 6周龄的商品鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组（每组20只鸡）：第1组用两 品化n下V弱毒疫茵点眼兔疫；第2组用：FPV－f VSB翅皮下注射免疫：第3组用鸡 痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射免疫；第4组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫 后4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含 rFPV－ILTVgB免疫组的SPF鸡或商品鸡均100％保护而免于死亡；！LTV弱毒疫苗免疫 的SPF鸡也获100％保护，但ILTV弱毒疫苗免疫的商品鸡在攻毒后有15％死亡；攻 毒后SPF鸡对照组死亡率为90％，商品鸡对照组死亡率为60％；所有二次免疫组没有 表现明显的免疫增强作用。免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV－ILTVgh诱导的抗ILTV 抗体水平与 ILTV弱毒疫苗相当；攻毒后进行的 ILTV分离和 PCR检测结果表明 ILTV 弱毒疫苗免疫的SPF 鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染，但在商品鸡上不如 rFPV－ILTVgB ti。 综合以上实验结果，重组鸡疽病毒rFPV－ILTVgB不仅能诱导体液免疫，也能诱导 机体产生针对ILTV的细胞免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病霉与现用 弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感 染，不会散毒。此外，该重组鸡疽病毒免疫的鸡可以通过血清学方法与自然感染ILTV 的鸡加以区别。因此，本实验研究的rFPV－ILTVgB疫苗将有希望从根本上取代现用的 ILTV弱毒疫苗，彻底改变ILT防制现状。