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表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力的研究

张绍杰  
【摘要】:鸡传染性喉气管炎 (Infection Lnyngotrcheitis Vrus,ILT)是由鸡传染性喉气管 炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各国,我国在 50年代发现本病,现己在许多省份流行。目前国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫 茵,但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点:(l)由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关, 因此,现用的疫苗毒力普遍偏强,接种后反应大;(2)与ILTV强毒一样,其弱毒疫 由株也能引起潜伏感染,潜伏感染的鸡将终主带毒;(3)疫苗病毒可以由接种鸡传染 给非接种鸡,在鸡与鸡,鸡群与鸡群之间传插过程中毒力会返强,从而成为新的感染 源;(4)到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。因此,研究新型安全且 有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。 糖蛋白 gB是ILTV的主要保护性抗原,它能诱导机体产生体液和细胞介导的保护 性免疫应答,是该病毒感染复制必需的蛋白。根据已经发表的ILTV SA。疫苗株的gB 基因序列,设计了一对特异性引物,然后通过PCR方法扩增了ILTV中国王岗株的gB 基因,并克隆到PUC质粒的EcORI位点中。序列分析结果表明克隆的PCR片段含 有2619hp核昔酸,包含了完整的gB基因阅读框架。序列比较分析结果显示,ILTV 王岗株(强毒株)的gB基因核昔酸序列与英国的Throne 882株和美国的632株(二 者均为强毒株)的 gB基因核昔酸序列完全一致,而与澳大利亚 SAZ株(弱毒株)的 gB基因核昔酸的同一性为99.8%,氨基酸的同一性为98.4%。三株ILTV强毒和弱毒 比较,弱毒 gB基因在第 89位和第 102位分别发生了一个碱基的插入和缺失,结果导 致5 个氢基酸的移码突变,即由强毒的“川*-C卜11eJie-*印”变成弱毒的 “GIy·切-Asn·Asn-Ser。 将克隆到pUCllg中的ILTV糖蛋白gB基因再亚克隆至杆状病毒转移载体 pVL1393中,形成重组质粒甲VLgB。将pVLgB与杆状病毒线性DNA(BAC-N-Blue DNA)共转染Sffi昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得重组杆状病毒pVL-ILTVgB。通 过PCR方法鉴定证明gB基因被正确插人到杆状病毒基因组中;直接免疫荧光试验结 果也表明 ILTV gB基因在重组秆状病毒感染的 Sfg昆虫细胞中被表达。表达的糖蛋白 gB作为亚单位疫苗用于下一步的免疫试验。 将克隆在pUCllg中的gB基因和大肠杆菌的L。Z基因分别亚克隆到禽痘病毒转 移质粒中 然后 将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S-FPV-017 t苗株感染的SPF I 张扭杰 双达传贝佐顺气管炎间写怵蠢困且阑禹区们@的构巨及江免沤戮力研灾 Zboo年6月 鸡胚成纤维细胞中,通过蓝斑筛选出重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB),并对其进行了 6 轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明,其基因组中含有完整的ILTV gB基 因:“巾悦*_.M删实验也证明了该重组病毒在其感染的sPr 4胚成纤维细胞中表达了 ILTV f蛋白gB。 用重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB等接种6周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试 验共设立7组(每组】0只鸡):第1组用商品化V弱毒疫苗点眼免疫:第2组用 rFPV-ILTVgB翅皮下注射免疫;第3组用鸡痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射兔疫;第车组 用rFPV-ILTVgB免疫2次,间隔2周;第5组用rFPV-ILTVgB一免,2周后用重组杆 状病毒表达的 ILTV gB蛋白二免;第 6组用含 ILTV gB基因的重组质粒一免,2周后 用 rFPV-ILTVgB二免;第7组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后 4周以致 死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。用重组鸡痘病毒rFPV-ILTVgB等接种 6周龄的商品鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组(每组20只鸡):第1组用两 品化n下V弱毒疫茵点眼兔疫;第2组用:FPV-f VSB翅皮下注射免疫:第3组用鸡 痘病毒弱毒疫苗翅皮下注射免疫;第4组为未免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫 后4周以致死剂量的ILTV王岗强毒株进行喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含 rFPV-ILTVgB免疫组的SPF鸡或商品鸡均100%保护而免于死亡;!LTV弱毒疫苗免疫 的SPF鸡也获100%保护,但ILTV弱毒疫苗免疫的商品鸡在攻毒后有15%死亡;攻 毒后SPF鸡对照组死亡率为90%,商品鸡对照组死亡率为60%;所有二次免疫组没有 表现明显的免疫增强作用。免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV-ILTVgh诱导的抗ILTV 抗体水平与 ILTV弱毒疫苗相当;攻毒后进行的 ILTV分离和 PCR检测结果表明 ILTV 弱毒疫苗免疫的SPF 鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染,但在商品鸡上不如 rFPV-ILTVgB ti。 综合以上实验结果,重组鸡疽病毒rFPV-ILTVgB不仅能诱导体液免疫,也能诱导 机体产生针对ILTV的细胞免疫,保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病霉与现用 弱毒疫苗具有同等的免疫效力,但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越,不形成潜伏感 染,不会散毒。此外,该重组鸡疽病毒免疫的鸡可以通过血清学方法与自然感染ILTV 的鸡加以区别。因此,本实验研究的rFPV-ILTVgB疫苗将有希望从根本上取代现用的 ILTV弱毒疫苗,彻底改变ILT防制现状。


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