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《中国农业科学院》 2001年
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表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究

乔传玲  
【摘要】: 禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合 征,广泛流行于世界上许多国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病力禽 流感(HPAI)多以突然发病和高死亡率为主要特征,常常导致感染鸡群的全群覆没, 被国际兽疫局列为A类烈性传染病。近几年来,在我国的一些地区也相继出现了AI的流 行,并于1996年,从广东鹅体内分离到对鸡具有高致病力的H5N1亚型AIV每株,这对 于我国的养禽业无疑是个极其危险的信号。一年后,97’香港禽流感直接传播给人并致 人死亡事件的发生,更加突出了AIV的公共卫生学意义。 为进一步阐明我国所分离的AIV毒株与香港流感毒株之间的关系,本研究对AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]的神经氨酸酶(NA)基因进行了RT-PCR扩 增、克隆与测序。结果所得到的NA基因cDNA包含完整的开放阅读框,全长为1410bp, 共编码469个氨基酸;通过与香港分离毒株A/Hongkong/156/97(H5N1)、A/Chicken/ HongKong/220/97(H5N1)、及A/Teal/Hongkong/W312/97(H6N1)和国内另一株鹅体分离 株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)[GD1/96]进行序列分析,结果发现它们之间核苷酸序 列的同源性分别为89.1%、89.1%、88.4%和99.0%,氨基酸序列的同源性分别为90.8%、 90.8%、89.8%和99.2%,与香港流感毒株相比,GD3/96 NA的茎部没有19个氨基酸残基 的缺失。以上结果表明香港流感毒株的NA基因不是由我国大陆的AIV毒株直接进化而 来的。 AIV最大的特点是亚型众多、抗原变异频繁,因而研制一种能够防制所有亚型的AI 疫苗是极为困难的。本研究为克服当前疫苗在不同HA亚型之间交叉保护力低的弱点, 拟针对AIV的另外两种结构蛋白NP和NA构建重组禽痘病毒(rFPV)或者将它们与AIV 的主要保护性抗原HA在rFPV中实现共表达,以期研制一种具有更高交叉保护力的重组 病毒疫苗。 将AIV GD1/96的核蛋白(NP)基因和大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)基因串联插 入到FPV载体中,构建能单独表达NP蛋白的rFPV转移载体;同时又分别将GD3/96 NA 基因和GD1/96 NP基因克隆到含有GD3/96 HA基因的重组转移载体中,构建含有HA- NA、HA-NP两种基因的转移载体。利用脂质体介导的方法将转移载体转染由亲本禽痘 病毒S-FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞。依据标记基因LacZ在细胞中是否表达,蓝白斑 法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及Western-blot分析,结果证明所获得的重 组病毒rFPV-NP、rFPV-HA-NP、rFPV-HA-NA遗传性状稳定,并能够对其重组的单个或 两个外源基因进行高效表达,且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学 特性及免疫学活性。 将重组病毒rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP、rFPV-NP和rFPV-HA分别经翅下刺种途径 免疫8周龄SPF鸡,同时设S-FPV-017免疫组和空白组对照。免疫后4周,分别用HPAIV GD1/96(H5N1)和KP(H7N1)进行致死剂量的攻击。通过检测血清学抗体和外周血液中 乔传玲 裹达内沉@清骂HA.NA.HA川P及NP g因重姐禽伍病霉的沟巨及耳免疫过力的研穴 中日农业科学院 CD3”、CD4”、CDS”及y8TCR”四种亚类T淋巴细胞的含量以及攻毒后鸡群消化道排毒、 发病和死亡情况来综合评价重组病毒的免疫效力。结果rFPV免疫后,所有鸡均被诱导产 生了高水平的*抗体和NP一、NA-特异性ELISA抗体::FPV-HA-NA与其它免疫组相比, 诱导产生*抗体的时间提前了一周。T淋巴细胞的检测结果表明rFPV免疫能有效激发机 体的细胞免疫应答,使免疫活性T细胞活化增殖,各类T细胞的百分比例均有所升高, 并且显著降低了因病毒攻击所导致的T淋巴细胞比例的下降幅度;而所有的对照鸡在攻 毒后,各类T淋巴细胞的百分比例均大幅度降低。rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP和rFPV-HA 免疫组对HSNI病毒的攻击均获得了100%的保护,它们对HWI毒株攻击的保护率分别 为100%、40%和0,而rFPV-NP免疫组对两种亚型病毒的攻击分别获得了40%和30%的保 护:S-FPV-0门免疫组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。重组病毒FFPV-HA-NA、 rFPV.HA.N-I,和rFPV.HA免疫组用HSNI病毒攻击后,在鸡的泄殖腔中都没有检出病毒的 存在,而rFPV-NP、S-FPV-0门免疫组和空白对照组均分离到了病毒的存在;当用H7NI 病毒进行攻击后,rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP、rFPV-NP和rFPV-HA免疫组病毒分离阳 性率依次为10O、250、33.3O、100o,而S-FPV-017免疫组和空白对照组均为100O阳 性。以上结果表明rFPV在鸡体内都能够稳定复制和高效表达外源蛋白,井能够诱导机体 产生特异性的体液和细胞免疫应答反应:表达产物中NA和*A是最具有免疫原性的,二 者的共表达能够使免疫鸡完全抵抗HSNI和H7NI亚型HPAIV的致死性攻击。 最后对rFPV-HANA的兔疫日龄、兔疫产生时间、免疫持续期及最小免疫剂量进行 了测定,结果大约含!0个PFU的重组病毒即能够诱导机体产生 100%抵抗强毒攻击的保 护力:免疫接种1日龄叩r鸡,4周后能完全抵抗*队IV的致死性攻击:两周和三
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S851.3;S852.65

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 乔传玲;表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];中国农业科学院;2001年
2 贾永清;表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];东北农业大学;2000年
3 侯小强;促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究[D];吉林大学;2010年
4 张文韬;基于量子点的禽流感病毒检测新方法探索[D];武汉大学;2010年
5 王群;H5N1亚型禽流感病毒核蛋白T细胞表位区的研究[D];中国农业科学院;2009年
6 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
7 朱光剑;中国南方H9N2禽流感病毒的分子进化分析及其对小鼠致病性研究[D];华东师范大学;2012年
8 刘学东;禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗的设计、表达制备及动物实验研究[D];中国海洋大学;2010年
9 丛立新;禽流感病毒感染SPF鸭抗体消长规律及相关microRNA表达研究[D];吉林大学;2012年
10 鞠湘武;H5N1型禽流感病毒损伤细胞溶酶体的机制研究和南极极端环境下科考队员的应激反应研究[D];北京协和医学院;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王全英;表达禽流感病毒NA1、NA2基因重组禽痘病毒的构建[D];内蒙古农业大学;2006年
2 左青山;共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];新疆农业大学;2007年
3 李俊辉;表达禽流感病毒H7亚型HA基因的禽痘重组病毒的构建及其免疫效力的评估[D];新疆农业大学;2008年
4 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
5 赵会连;不同处理和不同保存时间对重组(H5N1亚型,Re-5株)禽流感病毒效力的影响[D];河南农业大学;2010年
6 刘红彦;H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响[D];西北农林科技大学;2010年
7 孙宇;禽流感病毒血凝素的分离纯化以及快速评估其宿主特异性方法的研究[D];西北大学;2010年
8 王建琪;禽流感野鸭源分离株H2N2亚型和H3N8亚型基因特征及遗传进化分析[D];东北林业大学;2011年
9 林彬彬;禽流感病毒H9亚型福建分离株的全基因组测定及遗传演化分析[D];福建农林大学;2011年
10 张强哲;H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2003年
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