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《中国农业科学院》 2001年
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家蚕微孢子虫主要极丝蛋白(PTP33)基因和RAD基因的克隆与分析

高永珍  
【摘要】: 本文对两种对家蚕有病原性的微孢子虫(家蚕微孢子虫N.b和蓝萤叶 甲微孢子虫MPa)的极丝蛋白进行了抽提,并选择性分离、纯化了家蚕 微孢子虫N.b孢子的主要极丝蛋白PTP33,其分子量约为33kD,并对其 N端进行了氨基酸测序,共测了15个氨基酸。利用纯化PTP33制备了多 克隆抗体(anti-PTP Nb33),对该抗体利用Western Blot进行了特异性检测, 并利用该抗体进行了胶体金标记免疫电镜定位观察,进而对PTP33基因 和RAD37基因、反转录酶基因进行了研究。首次获得了微孢子虫的RAD37 蛋白的全长cDNA,并作为新基因提交到GenBank数据库中,为微孢子 虫的分子生物学研究增添了新的内容,也为微孢子虫的分类、家蚕微粒 子病的防治提供了新的思路。 一 家蚕病原性微孢子虫极丝蛋白的研究 通过KOH-KH_2PO_4处理使微孢子虫孢子发芽,极丝弹出后,用二硫 苏糖醇(DTT)抽提孢子极丝蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,再脱色后发现,所抽提得到的极丝蛋白 溶液在SDS-PAGE 图谱上出现分子量大小不同的八条以上的蛋白条带。 家蚕微孢子虫N.b和蓝萤叶甲微孢子虫MPa的图谱基本相同,都含有33kD 的主带;但二者中各条蛋白带的染色深浅不同,表明两种孢子中各蛋白 质的相对含量有所不同。在N.b孢子中33kD的蛋白主带非常明显,而 在MPa孢子有三条含量较大的蛋白条带,因此33 kD的蛋白主带并不明 显。两种孢子的极丝蛋白SDS-PAGE图谱明显不同于感染人的 Encephalitozoon属微孢子虫中得到的极丝蛋白的SDS-PAGE图谱。 选择性、分离纯化了家蚕微孢子虫N.b孢子的主要极丝蛋白PTP33, 经氨银染色法SDS-PAGE鉴定其纯度,图谱上只出现单一条带。经电转 移到PVDF膜上,用氨基酸自动测序仪测定其N端15个氨基酸的序列为: N-MASVAPPQGGIMVPN-C。纯化PTP-Nb33蛋白免疫家兔制备抗血清(多 克隆抗体),用ELISA法测其效价,滴度为1:102400。家蚕微孢子虫N.b 孢子和蓝萤叶甲微孢子虫MPa孢子的总极丝蛋白经SDS-PAGE分析后, 用制备的多克隆抗体(anti-PTP Nb33)进行Western Blot检测,发现其 特异性较好,只有PTP33蛋白相应处出现致密的杂交条带,并且MPa孢 子中也出现分子量相同的杂交带。利用获得的抗血清进行胶体金标记免 疫电镜定位观察,发现PTP33蛋白确实存在子N*抱子的极丝上,为极 丝蛋白。而且在MPa抱子中,该蛋白也存在于极丝上。这进一步显示了 .__.。_。。。__.._.。。。_.、.__._。 -制备得到的多克隆抗体的特异性较好。除极丝外,其它部位上基本无金 颗粒出现。由此也初步说明了该极丝蛋白在不同来源的、对家蚕有致病 性的微抱子虫中具有一定的保守性。 二家蚕微抱子虫N力抱子主要极丝蛋白基因的研究 根据家蚕微抱子虫N上抱子主要极丝蛋白PTP33的N-端氨基酸序列 和氨基酸密码子的使用偏好性分析结果,设计简并性引物,利用OligO (dT);。进行 RT-PCR。扩增出一条大约 600hp的 DNA条带,经回收纯 ._.___。__…__.。_.、__、_.__、_.__。_ 化、T叭 克隆法克隆、酶切鉴定后的阳性克隆进行核酸测序。测序后得 到的。DNA序列,应用Bi。Edit软件进行限制性酶切图谱分析和开放阅读 框架分析,发现其确实可以翻译成一段多肽。然后通过BLAST分析软件 在GenBank数据库里查询,寻找其同源性基因,发现这些基因大部分为 RAD基因,即 DNA repair Protein的基因。尤其是利用蛋白质查询,其 同源性高达67%。因此,初步认为所得cDNA序列为家蚕微抱子虫RAD @基因的一部分。 三家蚕微抱子虫N.b抱子RAD37基因的克隆、原核表达及体外翻译 所得到的家蚕微抱子虫抱子RAD基因的一部分。DNA序列,其3’ 端polyA尾巴和终止密码子(TGA)己经出现,说明此CDNA序列缺乏 的是 5’端序列,故而利用 SMA叮 RACE技术进行 5’lACE扩增,以 获得其 5’端序列。在离已知 CDNA序列 5’端约 200hp处设计特异性的 引物进行 5’一RACE,得到一条特异性的、长度约 600hp的扩增条带, 经克隆、测序后发现了与原序列重复的约200hp的序列和起始密码子 杏(ATGX 说明得到的 RACE产物确实是原序列的 5’端延伸,并且扩增 出了 5’端序列。将两部分序列拼接起来,得到全长为 1002hP的 CDNA 序列。虽然用Northern Blot未得到特异性的杂交带,但是用 RT.PCR扩 增出相同大小的条带。经测序后证实,是与拼接序列完全相同的序列, 从而验证了所得序列的正确性,也说明了其表达量较低,以至于用Northern BI*检狈不至。 用Bi。Edit软件分析所得到
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S884.21

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1 高永珍;家蚕微孢子虫主要极丝蛋白(PTP33)基因和RAD基因的克隆与分析[D];中国农业科学院;2001年
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