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冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆、序列分析和促冻杀虫基因工程菌构建

唐朝荣  
【摘要】: 细菌冰核基因的应用研究已成为生物冰核领域的研究热点,涉及细菌细胞 表面展示、报告基因、病原微生物高敏检测、作物抗寒育种等多个领域,显示 良好应用前景。在本研究开展前,我国尚未克隆到细菌冰核基因,因此无法开 展冰核基因的应用研究。大量研究证明,冰核细菌促冻杀虫理论确凿无疑,但 难以应用野生型冰核细菌冻杀田间和仓储越冬害虫,主要原因是这些冰核菌不 能在虫体内增生定殖,易被排泄体外,无法起到促冻杀虫作用;再者,冰核细 菌能在植物体上定殖,田间施用易诱发和加重植物霜冻,这已成为阻碍促冻杀 虫应用的国内外难题。基于此背景,拟本研究目标:克隆细菌冰核基因,利用 冰核基因构建促冻杀虫基因工程菌。主要结果如下: 根据已报道冰核基因的同源序列设计引物,通过PCR扩增从我们分离的冰 核细菌Erwinia ananas 110中克隆到一个完整细菌冰核基因。克隆基因编码区 全长3921nt,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端(161aa)、C-端 (41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区(1104aa),以16氨基酸为 重复单元的R区占整个编码序列的84.5%。序列比较表明所克隆的基因为新基因, 将其命名为iceA,并已在GenBank上的登录,登录号为AF387802。所克隆基因 同国外报道的冰核基因inaA的同源性最高,核苷酸和氨基酸的同源性均为94%。 构建了所克隆基因的非融合原核表达载体pINA201,成功实现了冰核基因的原 核表达,产生187KDa的冰核基因表达产物。 将iceA插到质粒pSZ21的Tn5转座子的SalI和BamHI酶切位点之间,首次成 功构建了具广泛宿主接合转移和Tn5转座功能的重组质粒mob-Tn5-iceA。在该 重组质粒中,iceA在Tn5转座子的新霉素磷酸转移酶基因启动子控制下实现了 冰核基因的组成型活性表达,可通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入多种革兰氏 阴性菌,并进一步通过Tn5转座将插入在其上的冰核基因iceA整合到宿主菌染 色体DNA上,因此该重组质粒的构建将加速冰核基因的应用研究。 首次通过接合转移将mob-Tn5-iceA导入阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 1.181和1.2022两个菌株中,并通过Tn5转座作用进一步将冰核基因iceA整合到 宿主菌染色体DNA上,成功构建了冰核活性稳定的促冻杀虫基因工程菌Enc181~(ice) 和Enc2022~(ice)。 0二 两株工程菌可显著提高害虫的过冷却点,在害虫肠道能有效定殖、对害虫 的低温冻杀效果明显。用工程菌饲菌后7d内,玉米螟和棉铃虫的过冷却点分别 从-11℃一 17℃和-10 C左右提高到-3℃一4℃,饲菌后gd,处理虫体的过冷 却点有所降低,但仍在-5’C以上。在饲菌后7d内,两种昆虫肠道的工程菌数量 高达10‘~105C刊u/虫体,饲菌后gd,虫体肠道内的工程菌数量有所下降,但每 虫体的菌体数量仍在10‘cfu以上。将饲菌后6d的玉米螟和棉铃虫在-5’C处理 6h,即有90%以上被冻死,而未经工程菌处理的对照虫体则全部存活下来;-7 C处理6h,工程菌处理虫体 100%被冻死,而对照玉米螟和棉铃虫中则分别仅有 7.4%和14.3%被冻死。 两株工程菌在植物体上的附生定殖能力明显低于野生型冰核细菌,大田应 用冻杀害虫时会降低诱发霜冻的风险。盆栽试验显示,工程菌在玉米上的定殖 能力明显比野主型冰核细菌低。在喷菌后10d,从玉米叶片上很难再分离到 Enc2022‘“”,表明该菌难以在植物上定殖,Enc181‘””虽然在喷菌后20d内在玉米 上始终有一定数量定殖,但与野生型冰核细菌Eal 10+肚b则要低2个数量级以 上。此外,两个工程菌间在植物上的定殖能力也存在明显差异,无论在盆栽试 验的玉米上或是在小区试验的玉米和棉花上,Enc2022‘’”的定殖能力都明显低 于Enclsl‘“”:在植物体上难以定殖,可排除诱发霜冻的风险,因此大田应用 Enc2022‘””促冻杀虫更具应用前景。 本项研究结果,为我国冰核基因应用研究创造了新的生长点和奠定了基 础,创制出了促冻杀虫新生物农药,为防除我国三北地区重要越冬农林害虫和 仓储害虫指出了一条切实可行的生防新途径。


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