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《中国农业科学院》 2001年
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逆转录病毒介导的特异性反义RNA和核酶抑制禽流感病毒复制的研究

孟庆文  
【摘要】:禽流感(A!)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的疾病,被国际兽疫局 确定为I类烈性传染病,对养禽业的危害甚大,高致病力禽流感病毒(HPAIV)造成的 死亡率高达100o。1997年,在香港有18人感染了HSNIt流感病毒。1999年,又有2 人感染了HgNZ禽流感病毒。这表明川 可有限地感染人,更突出了其公共卫生意义。 由于AIV的变异快、亚型多,使禽流感的防治面临严峻挑战。因此,探讨禽流感新型防 制策略显得尤为迫切。 本研究根据反义NA作用机制,以AIV复制过程中起重要作用的保守基因NP。 PB、PBZNP为靶标,设计与其 InRNA互补的特异性反义 RNA以及特异性剪切的核酶, 探讨在细胞水平上抑制AIV夏制的策略,为防制A*提供新的途径。 i据反义 NA作用机理,以 AIV A/ChickenjXifljiang/96(H14NS)全长 cDNA及 5’ 端三50hp 含完整的5’端非编码区和部分编码区),以及AIV A/Goose/Guangdongil/96 (HSNI)PB CDNA 5’端 365hP和 93 hp(都包含完整的 5端非编码区及部分编码区) 为目的基因,反向插入到逆转录病毒载体p;xSN中,分别命名为plxas-NP、plxas-5’-NP、 Plxass’-PB和 Plxas-PB。用磷酸钙共沉淀和脂质体介导法转染包装细胞系 PA3 7。经 G4旧筛选抗性克隆,扩增单个丸隆,收耿培养上情中的重组逆转录病毒。将重组逆转录 病毒感染滴定细胞系N!H3*Z,各筛选到高滴度产毒细胞克隆、将重组逆转录病毒感染 AIV许可性细胞系MDCK,叭DNA水平险测到目的基因的整合,用巢式r-PCR法证 实日的基因的表达。uh明已建立了表达特异性反义RNA的抗A*的细胞系,分别命名 J] MPXAs-NP、MplX。-5’-NP、MP[Xffes-PBI和 MpIXAs-P81、用 AIV接种抗 A*的 细胞系后,通过血凝试验表明,逆转录病毒介导的特异性反义NA抑制了AIV的复制。 根据 Symons介绍的锤头状核酶结构,以 AIV A/Goose/Guangdong/l/96(HSNI)PBI。 PBZ mRNA为靶标,借助汁算机软件辅助设汁,并分析底物的二级结构,找到可能成人 核酶切割的 2个位点(PB的 151位点;PBZ的 44位点),设汁并构建了带有 5、is-RZ 和3’-ets-Rz的自剪切体外转录质粒,将其分别命乞j]卜ZPB、As44lPBZJ同时将核% 切割底物基囚片段克隆入体外转录质粒 T-vector上,分别命名 IJ Tpb、TpbZ;经体外转 录分别获取以’‘卜标记的核酶和靶A,升对靶A进行核酶的体外切割实验。酶动 力学分析表明,RzPB、RzPBZ均有特异、高效地切割两个靶 RNA的活性。用 XhOI. Sail双酶切 ePB、RzPBZ,将带有 5-ets-s和 3’-ets、Rz的自剪切核酶,分别单独 充隆或串联克隆入plxHS中,KJ建了逆转录病毒核酶表达质粒和鸟枪型逆转录病毒核酶 表达质粒,将其分别命名为 pxRzPB、plxRzP82和 plXAB。用脂质体介导法转染包装 细胞系 PA3 7,经 G4旧筛选抗性克隆,扩增培养;收脓房养上清中的重组逆转录病毒, 盂庆文 迎转录瞩霉介导的特异性反义nA和幢回抑制禽流日清每复制的研灭 00I年6月 以其感染川V许可性细胞系MDCK,通过PCR从DNA水平上证明*o”基因的整合, 巢式 RT.PCR方法检测到 Neo”基因的表达,从而建立了表达特异性核酶的抗 AIV的细 胞系,分别命名为 MplaltzrB、帅lxRz44 PBZ和 MplxAB。将 AIV $染此抗性细胞系 后,血凝试验结果表明,逆转录病毒介导的特异性切割核酶抑制了AIV的复制,并且多 靶标鸟枪型核酶具有协同作用。 为了证实绿色荧光蛋白(gTeen luorescent protein,GFP)作为报告基因和筛选标记 的可行性,本研究构建了绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pCDNA;GFP,并观察了其 在 MDCK细胞系中的表达。以 Notl切取 pCIGFP的 GFP基因后插入真核表达载体 pcDNA;中,以BamHI鉴定方向,用pCDNA。GFP以LpofectAMINET’vi转染MDCK培养 物,经 G4筛选阳性克隆,荧光显微镜下观崇。结果证实,成功地构建了含 GFP cDNA 的真核表达质粒pCDNA3GFP,转染的MDCK阳性克隆在荧光显微镜下呈绿色。GFP基 困可在MDCK细胞中表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。 本研究首次探讨了特异性反义RNA和核酶对AIV复制的抑制作用。这些结果表明, 特异性反义RNA和核酶在基因水平上直接抑制AIV,可以作为一种有潜力的抗AIV制 剂,对A*的防制以及人类IV的基因治疗有重要意义,也为培育抗AIV的转基因动物 模型以及抗川 的转基因禽类育种莫定了物质基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
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1 吕素芳;郭广君;肖跃强;沈志强;;逆转录病毒载体及其在动物病毒病的研究进展[J];动物医学进展;2011年02期
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1 刘殿峰;蚓激酶基因在牛乳腺中的表达及其转基因兔的建立[D];吉林大学;2006年
【参考文献】
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1 陆长德,陈农安,祁国荣;核酶对靶RNA的体外切割反应的计算机分析[J];生物化学与生物物理学报;1996年03期
2 周盛梅,孟凡国,黄大年,黄纯农;绿色荧光蛋白及其应用[J];生物工程进展;1999年02期
3 张建林,于康震,陈化兰,唐秀英,田国斌;禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)全基因克隆及序列分析[J];中国预防兽医学报;2000年03期
4 于康震,陈化兰,唐秀英;'97香港禽流感[J];中国畜禽传染病;1998年03期
5 章金钢,涂长春,金扩世,李红卫,胡敬东,扈荣良,戴秉丽,殷震;体外培养细胞中特异反义RNA表达对猪瘟病毒增殖的抑制作用[J];中国兽医学报;1995年01期
【共引文献】
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1 谢永芳,舒坤贤,梁亦龙,袁帅,张继承;小鼠胚胎发育中期肠细胞增殖与凋亡的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年01期
2 王子良,许丽艳,李恩民;质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响[J];癌变.畸变.突变;2005年02期
3 康振桥;季艳霞;杨志勇;苏光;崔彦芝;;血管内皮生长因子亚型在人乳腺癌细胞中的表达差异[J];癌变.畸变.突变;2006年03期
4 朱吉;李文林;金彩霞;李建秀;胡以平;;绿色荧光蛋白多克隆抗体的制备[J];癌变.畸变.突变;2007年01期
5 安刚;黄天华;谢庆东;王德刚;;pCXN2-mIZUMO对C57BL/6小鼠生育能力的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年04期
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7 毕玉平,廖俊杰,单雷,王兴军,徐平丽;番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究[J];山东农业科学;1997年06期
8 单雷,毕玉平,王兴军,徐平丽,李广存;双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析[J];山东农业科学;1998年04期
9 葛宏华,孙莉宁,张其瑞;家蚕血淋巴蛋白的发育变化和BmLSP的纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2001年03期
10 王北艳;曹宁;汤晖;;苜蓿中华根瘤菌电转条件的优化[J];安徽农学通报;2008年11期
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2 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
3 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
4 黄瑜;彭春香;李文杨;程龙飞;施少华;徐斯良;;水禽流感[A];福建省科协第二届学术年会卫星会议动物传染病防制与人类健康研讨会论文集[C];2002年
5 商庆龙;谷鸿喜;;HPV16 L1蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性研究[A];庆祝黑龙江省免疫学会成立十周年(1993—2003)论文集[C];2003年
6 陈振文;赵太云;孙贺娟;路静;王迎;孟霞;曹争和;王钜;;微卫星DNA与生化标记分析对长爪沙鼠群体遗传分析的比较[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
7 王革;王妍;何凌冰;乔刚;朱一松;王君艳;;酵母分泌表达重组人神经生长因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
8 任华;顾建华;孙竹筠;沈万赟;吴鹰;周忠良;;RT-PCR法检测斑马鱼(Danio rerio)卵黄蛋白原mRNA表达[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
9 马珺;陈云霜;王爱善;李仲逵;;珍稀鸟类东方鹳的性别鉴定[A];2005年上海市动物学会学术会议论文集[C];2005年
10 马勋;陆承平;;猪戊型肝炎病毒新疆分离株全基因序列的分析[A];中国科协2005年学术年会“新疆现代农业论坛”论文专集[C];2005年
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10 郑燕芳;抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌细胞株表型和基因调控的影响[D];第一军医大学;2000年
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7 文又武;cFLIP反义寡核苷酸纳米粒子治疗结肠癌的基础研究[D];重庆医科大学;2011年
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9 王辉;利用毒蛋白基因提高棉花转化效率的研究[D];石河子大学;2009年
10 潘文宝胜;H9N2广西分离株HA基因序列分析及越南与中国学生H9亚型抗体水平检测[D];广西医科大学;2012年
【同被引文献】
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1 邱松波,樊俊华;动物基因转移技术——逆转录病毒载体法研究进展[J];黄牛杂志;2000年01期
2 刘荣,金萍;蚓激酶胶囊治疗缺血性脑血管病94例临床观察[J];当代医师杂志;1998年08期
3 韩晓荣;柳纪省;杨彬;孙瑜隆;李建强;兰喜;殷相平;李宝玉;李学瑞;胡永浩;;亚洲1型口蹄疫病毒反义核酸双向表达载体的构建[J];动物医学进展;2008年03期
4 张克忠,崇松,陈立,卢大儒,薛京伦,邱信芳;人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究[J];复旦学报(自然科学版);1998年04期
5 陈炳旺,游景成,汪培清,倪村,林金忠,严萍;普恩复对冠心病血液流变学和血小板聚集的影响[J];福建中医学院学报;1997年01期
6 曹阳,高华颖,李庆伟,安利佳;精子干细胞转染法制备转基因兔的研究[J];高技术通讯;2001年10期
7 饶育雄;章公大;唐秋行;饶敏;;广州蚯蚓体腔液酶溶纤维蛋白作用的初步观察[J];广州医学院学报;1986年03期
8 于晓龙;猪传染性胃肠炎病毒sM基因反义逆转录病毒的包装和鉴定[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;2005年04期
9 贺石林,彭延古,李安国,唐荣德,易小兰,彭学著;地龙提取液的抗凝作用与毒性[J];湖南医科大学学报;1990年02期
10 胡建宏,李青旺,王立强,江中良,于永生,解广勤;转基因动物研究进展[J];家畜生态;2004年02期
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1 徐青;山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年
【二级引证文献】
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1 周学章;纳玮;;滩羊β-防御素基因的克隆和表达[J];中国兽医杂志;2012年12期
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1 苗丽君;慢病毒介导的mTOR靶向抑制对肺腺癌A549细胞生物学功能的影响[D];郑州大学;2012年
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1 张洋;CDK2与DOC-1在肺癌组织中的表达及其意义[D];华中科技大学;2012年
【二级参考文献】
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1 金哲元,陆长德,李光地,祁国荣;定点切割甲型肝炎病毒RNA片段的Ribozyme的设计和性质的研究[J];病毒学报;1993年01期
2 陆长德,庄旻,祁国荣;Ribozyme和靶RNA的相互作用对于切割反应的影响[J];高技术通讯;1994年04期
3 胡维民,黄自然,陆长德,祁国荣;专一地切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白mRNA的ribozyme的设计与性质[J];昆虫学报;1993年03期
4 唐秀英,田国斌,赵传删,周金法,于康震;中国禽流感流行株的分离鉴定[J];中国畜禽传染病;1998年01期
5 郭元吉,徐西雁,万秀峰,王敏,郭俊峰;一株鹅H5N1亚型流感病毒基因特性的分析[J];中华实验和临床病毒学杂志;1998年04期
6 陈化兰,于康震,步志高;一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析[J];中国农业科学;1999年02期
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1 李曦,田国彬,唐秀英,于康震;禽流感病毒河北株的分离鉴定[J];中国预防兽医学报;2000年S1期
2 刘金华,田克恭;高度重视高致病性禽流感病毒的公共卫生学意义[J];中国实验动物学报;2004年04期
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5 ;中国成功完成禽流感病毒关键结构解析[J];中国牧业通讯;2009年04期
6 ;美研究发现抗多种流感病毒人单克隆抗体[J];生物工程学报;2009年03期
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8 郑腾,陈枝华;禽流感病毒致病性的分子生物学基础及研究近况[J];黑龙江畜牧兽医;2002年02期
9 戚凤春,盛军;禽流感病毒与人流感的关系[J];微生物学杂志;2004年05期
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5 何义林;叶冬青;;禽流感病毒对人类感染机制的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
6 李英霞;杨丽丽;高睿;;禽流感的危害与防制[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
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9 刘桂林;张小辉;王锦平;;禽流感病毒H6N2亚型NA基因序列相关肽链特性及其二级结构分析[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
10 ;热电在AnalyticaChina 2006展出禽流感检测仪器[A];第三届科学仪器前沿技术及应用学术研讨会论文集(二)[C];2006年
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1 本报记者 王均珠;贵阳制定三项措施防范“人禽流感”[N];贵阳日报;2005年
2 新华社记者  卢苏燕;人类如何赢得与禽流感的赛跑[N];光明日报;2006年
3 颜亮;新年禽流感在全球卷土重来[N];经济参考报;2007年
4 本报记者 叶芳 通讯员 邹钦;多休息勤洗手 远离禽流感[N];广东科技报;2008年
5 黄显斌;对付禽流感:三十六计“走”为上[N];大众科技报;2005年
6 朱玉;禽流感还要“飞”多远?[N];科技日报;2005年
7 见习记者 杨茜;我市防控禽流感进入[N];嘉兴日报;2005年
8 张孟军;禽流感病毒H5N1正在突变[N];科技日报;2004年
9 李学梅;此次流感病毒并未发生大变异[N];北京日报;2007年
10 肖玮;首款抗禽流感中药面临难产[N];北京商报;2007年
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1 侯小强;促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究[D];吉林大学;2010年
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3 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
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5 杜元钊;新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究[D];南京农业大学;2011年
6 鞠湘武;H5N1型禽流感病毒损伤细胞溶酶体的机制研究和南极极端环境下科考队员的应激反应研究[D];北京协和医学院;2012年
7 柴洪亮;黑龙江地区野生鸟类禽流感的分子流行病学调查研究[D];东北林业大学;2012年
8 郭晓莉;基于生物信息学的禽流感H5N1病毒高致病性和传染性的研究[D];上海交通大学;2008年
9 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年
10 李永强;H5N1禽流感病毒PB1 T677M 位点与PB2 I63T位点对病毒毒力的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
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1 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
2 赵会连;不同处理和不同保存时间对重组(H5N1亚型,Re-5株)禽流感病毒效力的影响[D];河南农业大学;2010年
3 刘红彦;H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响[D];西北农林科技大学;2010年
4 孙宇;禽流感病毒血凝素的分离纯化以及快速评估其宿主特异性方法的研究[D];西北大学;2010年
5 王建琪;禽流感野鸭源分离株H2N2亚型和H3N8亚型基因特征及遗传进化分析[D];东北林业大学;2011年
6 林彬彬;禽流感病毒H9亚型福建分离株的全基因组测定及遗传演化分析[D];福建农林大学;2011年
7 张强哲;H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2003年
8 王章泽;安徽与辽宁部分农村卫生人员人/禽流感防控知识知晓现况研究[D];安徽医科大学;2010年
9 黄娟;单抗介导的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)快速检测禽流感病毒[D];河南农业大学;2003年
10 宫爱艳;鸡源抗禽流感病毒Fab噬菌体抗体库的构建研究[D];西南农业大学;2005年
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