胆固醇氧化酶基因的克隆、融合及在大肠杆菌和植物中的表达

【摘要】： 胆固醇氧化酶基因是近几年才发现的一种抗虫蛋白质，它对敏感害虫——鞘 翅目的棉铃象甲的毒杀能力与早期发现的Bt.毒蛋白相当，对鳞翅目的一些害虫 如烟蚜夜蛾等也有较强的抑制其生长发育的作用。因为它的毒杀能力强，而且其 杀虫谱又与现在广泛使用Bt.毒蛋白具有一定的互补性，所以被认为是继Bt.毒蛋 白之后的第二代杀虫蛋白的代表之一。 本研究从4个分泌胆固醇氧化酶的实验菌株中，筛选出两个高产酶菌株 TK54和T12，用其上清进行杀虫实验发现，胆固醇氧化酶具有较强的抑制棉铃 虫生长的活性。采用PCR方法，从TK54菌株中扩增出特异DNA片段，对片段进行 克隆、亚克隆之后测序分析，该扩增片段全长1，644bp，为胆固醇氧化酶的编码序 列，与从另一链霉菌菌株中分离的胆固醇氧化酶基因choA有97.6%的同源性，属同 一基因家族成员，命名为choa。 利用pBV221和大肠杆菌BL21表达系统，构建了胆固醇氧化酶全酶和成熟 酶基因表达载体，在BL21中表达的结果是包含前导肽编码序列的全酶基因在 BL21中以包涵体的形式高效表达（表达量占菌体总不溶性蛋白的75.4%），而无 前导肽编码序列的成熟酶基因则未观察到表达。进一步PCR扩增前导肽编码序 列，并重新插入到成熟酶基因5’端，回复前导肽编码序列的成熟酶在BL21中也 能高效表达出了与全酶相同基因的蛋白带，结果证明前导肽为胆固醇氧化酶在大 肠杆菌中高效表达方面起着极其重要的作用。进一步分析前导肽序列，发现其在 3’端有一个回文序列结构，推测此回文结构是导致高效表达的重要元件。以上结 果目前尚未见类似报道。 构建了胆固醇氧化酶全酶基因和成熟酶基因的单价基因植物表达载体；并与 Bt cry LA基因一起，又构建了双价基因植物表达载体和融合基因植物表达载体。 利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了转6种植物表达载体的转基因烟草植 株。PCR扩增、Southern杂交等方法检测转基因植株，证明了外源基因在转基因 烟草植株基因组中的整合。转单价胆固醇氧化酶全酶基因和成熟酶基因的转基因 烟草植株均不能对棉铃虫产生直接的致死作用，但能使棉铃虫的生长发育受到一 定程度的抑制。而且全酶基因的转基因烟草有更好的抑制棉铃虫效果。 IRff 2 在转双价基因的转基因烟草中，含全酶基因的植株具有相对较高的抗虫性， 而在转融合基因的植株中，含成熟酶基因的转基因植株抗虫性较好，进一步说明 全酶基回的形式有利于胆固醇氧化酶基因在植物中的表达，而成熟酶则是胆固醇 氧化酶在植物体内发挥活性的主要形式。 转单价全酶基因和转双价全酶基因的烟草植株具有较高的胆固醇氧化酶活 性，悦明在转基因植物中，前导肽编码序列仍然有助于基因的表达。 转双价基因的转基因棉花植株，前后期抗虫性存在显著差异，而转融合基因 的棉花植株，在前后期都有极强的抗虫性，证明融合基因优越于双价基因，利用 基因工程将Bt杀虫蛋白与胆固醇氧化酶融合进行蛋白质改造，目前未见国内外 类似报道，是今后研究的重要方向之一。 另外，双价基因转化棉花时使用的是 pUC载体，融合基因使用的是 pBI二 载体，虽然目前还不能明确指出后者所携带的TDNA序列和左右边界序列在外 源基因稳定整合中的作用，但从转融合基因的棉花植株抗虫性比转双价基因的棉 花植株稳定来看，载体也是影响外源基因在转基因植物中稳定整合以及表达的一 个关键回素，因而在进行植物遗传转化时，载体的选择至关重要。