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《中国农业科学院》 2001年
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植物顶端组织高效诱导型启动子的创建与表达调控研究

苟吉庆  
【摘要】: 目前,启动子的研究是国内外的一个研究热点,现已发现了大 量组织特异性启动子和诱导型启动子。在仔细研究了这些特异性启 动子的结构特点,以及其中起决定作用的顺式作用调控元件的基础 上,本文从中选择了两个研究背景比较清楚、序列结构具有共性的 植物顶端新生组织特异性调控元件B1元件和水杨酸诱导型调控元 件as-1元件进行了进一步研究。 以35S启动子的基本框架结构(-90至+1区间的序列)为基础, 利用人工合成的这两个调控元件进行重新组装、构建了九个分别含 有一个、两个、四个B1元件和as-1元件的系列启动子和带有gfp 基因的质粒,将它们分别命名为pUC191B1a.GFP、pUC191B2a.GFP、 pUC191B4a.GFP、pUC192B1a.GFP、pUC192B2a.GFP、pUC192B4a.GFP、 PUC194B1a.GFP、pUC194B2a.GFP和pUC194B4a.GFP。并进一步 分别构建出九个不同的植物表达载体,分别命名为pBI1B1a.GFP、 pBI1B2a.GFP、pBI1B4a.GFP、pBI2B1a.GFP、pBI2B2a.GFP、pBI2B4a.GFP、 PBI4B1a.GFP、PBI4B2a.GFP、pBI4B4a.GFP。利用农杆菌介导的叶 盘转化法转化烟草,通过高浓度的卡那霉素连续筛选,最终获得186 株转基因烟草植株。经过荧光显微镜初步筛选,获得含有1B1a启 动子的植株9株、1B2a启动子的植株12株、1B4a启动子的植株14 株、2B1a启动子植株8株、2B2a启动子的植株11株、2B4a启动子 的植株9株、4B1a启动子的植株15株、4B2a启动子的植株15株 和4B4a启动子的植株19株。经PCR扩增和Southern blot分析表明 各种表达载体已分别整合进转基因烟草植株的基因组中。 以每种启动子的转基因烟草植株为一个小群体,分别利用荧光 显微镜在蓝色激发光下观察各种转基因烟草植株中各组织部位的 GFP表达水平,并利用荧光分光光度计在460nm激发光和509nm 发射光下对不同部位叶片中GFP的表达量进行了定量分析。两种不 同的分析方法一致证明:(1)含有B1顺式作用元件的启动子具有在 植株顶端叶片和茎尖中表达的组织特异性,其在茎中的表达也主要 行 男 二 集中在茎的外表皮和韧皮部组织。仅旧 元件具有累加效应,启动 子中含有BI 元件越多,该启动子在顶端组织特异性表达就越强, 含有四个 田 元件的启动子的顶端组织特异性最显著。在转基因烟 草植株的同一部位,含有四个 * 元件启动子的表达水平是含有两 个田元件启动子表达水平的2.9倍,是含有单个BI元件启动子表 达水平的3.9倍,含有两个BI元件启动子的表达水平是含有单个BI 元件启动子表达水平的 1.3倍。o)含有相同 BI元件而 asJ元件数 目不同的三种启动子的表达水平没有明显差异,说明正常条件下含 有 BI 元件和 as1元件启动子的表达水平主要由 BI 元件的多少决 定,而不受asJ元件的影响。 在应用ZmM、20mM和50mM水杨酸溶液喷洒转基因烟草植株 叶片后,在不同时间段内选取同一部位的叶片,通过荧光显微镜观 察和荧光分光光度计测量两种方法,定性、定量地分析了不同浓度 的水杨酸诱导下含有不同启动子的转基因烟草植株中GFP表达水平 的变化。两种方法一致证明:(1)as-1 元件能赋予启动子水杨酸诱 导特性。(2)水杨酸的诱导效果与所喷洒水杨酸的浓度及 的值密切 相关,供试溶液中以50mM PH6.8 的水杨酸溶液诱导效果最佳。(3) 水杨酸诱导后基因表达水平的增长幅度与启动子中as-1元件的数目 密切相关,含有单个asJ 元件的启动子在诱导后表达水平比诱导前 提高2.2~2.8倍,含有两个asJ元件的启动子在诱导后表达水平比 诱导前提高3~3.5倍,含有四个asA元件的启动子在诱导后表达水 平比诱导前提高 13~17倍。O)增加 BI顺式作用元件数目有协同增 强as八元件表达的作用,含有四个BI元件和四个as八元件的4B4a 启动子,其不但具有很高的顶端叶片和茎尖组织特异性,而且在水 杨酸诱导后 24小时左右,其表达水平比诱导前可提高 17.3倍。如 此高效表达目前未见类似报道。 本研究结果有力地证明了来自启动子中的组织特异性BI元件 和诱导性as1元件,可被直接用于改造或构建人工融合启动子, 并赋予启动子组织特异性表达的特性和水杨酸诱导特性,这一研 MK 3 究结果为今后构建组织特异性或诱导型启动子提供了依据。 将BI和as-1顺式作用调控元件串联叠加起来构建成新型的、 既有顶端组织特异性又有水杨酸诱导性并能高效表达的启动子, 目前尚未见到类似报道。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q943.2

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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4 王钰;潘光堂;;具有高再生性且对农杆菌C58敏感的玉米自交系材料的筛选[A];2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(二)[C];2005年
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6 冯怀蓉;王炜;常玮;茆军;余荭;;Ri质粒研究进展[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
7 郭剑华;杜涛;侯明生;;转Shiva-1基因泡桐的遗传及生物学性状分析[A];湖北省植物病理学会2002年学术年会论文集[C];2002年
8 焦晓国;张国安;涂巨民;崔旭红;;转Bt基因水稻抗虫性测定[A];华中昆虫研究(第一卷)[C];2002年
9 王才林;赵凌;朱镇;张亚东;林静;张所兵;陈涛;刘贤金;王冬兰;黄骏麒;龚蓁蓁;;用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因导入水稻获得转基因植株[A];植物分子育种——第四届全国植物分子育种学术研讨会论文集[C];2004年
10 张志刚;李育强;周世象;肖才升;杨春安;王洪;;我国转基因棉的研究进展与可持续发展对策[A];中国棉花学会2005年年会暨青年棉花学术研讨会论文汇编[C];2005年
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1 齐春辉;日本结楼草(Zoysia japonica Steud.)植株再生体系建立与DREB1A基因转化研究[D];北京林业大学;2005年
2 周晓红;弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究[D];第一军医大学;2004年
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5 易自力;外源基因转化南荻和籼稻的研究[D];湖南农业大学;2000年
6 杜海莲;禽流感病毒(H5N1)基因(h5n1a)在马铃薯中的转化与表达研究——附:乙肝表面抗原(HBsAg)基因转化的对比研究[D];福建农林大学;2000年
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8 张永军;外源Bt杀虫蛋白与棉花抗虫次生物的互作关系及转Bt基因棉花诱导抗虫性的研究[D];中国农业科学院;2000年
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10 王冰山;Germin基因的克隆和人溶菌酶基因的合成及其在烟草和油菜中的表达[D];中国农业科学院;2000年
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1 史俊;水稻强分蘖基因MT1的克隆研究[D];扬州大学;2006年
2 段金秀;杜氏盐藻钙依赖蛋白激酶CDPK基因的克隆、表达载体的构建及对拟南芥的遗传转化[D];甘肃农业大学;2006年
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4 康保珊;转基因抗虫棉抗虫基因拷贝数对蛋白表达及遗传的影响[D];山西农业大学;2004年
5 杜春芳;花粉介导法在油菜转基因育种中的应用研究[D];山西农业大学;2004年
6 曾凡锁;转基因白桦中外源基因整合表达稳定性与遗传变异分析[D];东北林业大学;2005年
7 王凯;双抗虫基因共转化四倍体菘蓝的研究[D];第二军医大学;2005年
8 王亮;利用重组F26G实现呋甾皂苷向螺甾皂苷生物转化的研究[D];沈阳药科大学;2001年
9 邓智年;豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及植物表达载体的构建[D];广西师范大学;2001年
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【同被引文献】
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1 高峰;盐芥耐盐相关基因的克隆及功能分析[D];山东大学;2006年
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3 陈双燕;T-DNA标签在水稻基因组中的分布与特征[D];浙江大学;2003年
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3 杨永智;水稻大规模增强子捕获系群体的创建与初步分析[D];中国农业科学院;2004年
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【二级参考文献】
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