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《中国农业科学院》 2002年
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橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1所产木聚糖酶的纯化、酶基因的克隆及表达

张红莲  
【摘要】: 木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖和木糖。木聚糖酶在饲料、制浆造纸、食品、能源工业中都显示出广阔的应用前景。许多微生物可产生木聚糖酶。我们选择的实验材料是一株橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)。此菌株能胞外分泌木聚糖酶。从它的培养液中分离纯化出两种木聚糖酶:43kD的XYNA及23kD的XYNB。XYNA的最适温度为60℃;最适pH为5.6;在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan的K_m值和V_(max)分别是3.32(g/Kg)和15.72(μmol/ml·min);SDS、EDTA对它有轻微的抑制作用;XYNA无纤维素酶活性;胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30分钟,对酶活性无影响。XYNB的最适pH为5.2,最适温度为60℃,在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan为底物的K_m值和V_(max)分别为22.1(g/Kg)和105.26μmol/ml·min。Mg~(2+)、Cr~(3+)对XYNB有轻微的激活作用。XYNB无纤维素酶活性。胃蛋白酶、胰蛋白酶37℃下处理30分钟,对酶活性无影响。将纯化出的XYNA及XYNB进行N端序列测定。结果XYNAN端十个氨基酸序列与已发表的木聚糖酶FXYN的100%同源,所以直接根据所发表的编码FXYN的基因全序列资料,设计和合成了二段引物,利用PCR技术,克隆出xynA1全序列,测序结果与发表的编码FXYN的基因序列完全一样,再分别克隆出不含信号肽的xynA1-w和含有信号肽的xynA1-s序列,并分别将两段基因克隆进大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中都得到特异性表达,并且都能检测到木聚糖酶活性。将xynA1-w序列克隆进酵母表达载体上,在毕赤酵母GS115中得到高效特异性表达。XYNB N端十个氨基酸序列与已发表的最高同源性为90%,根据N端序列测定结果及C端保守序列分别设计了两段引物,经PCR扩增出编码XYNB成熟蛋白的核苷酸序列。将此序列克隆进表达载体pET-22b(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中也得到特异性表达,并有正常的生物学活性,证明了基因xynB1的生物学功能。将xynB1序列克隆进酵母表达载体pPIC9α上,在毕赤酵母GS115中得到高效特异性表达。对xynA1与xynB1的核苷酸序列进行分析,发现它们之间的同源性仅为40%,并可以断定XYNA属于F/10组木聚糖酶,而XYNB属于G/11组木聚糖酶。 将所测出的基因xynB1的成熟蛋白部分核苷酸序列与GeneBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较,最高同源性为86%,氨基酸序列最高同源性也为86%,并且与之同源性最高的基因所表达的酶酶学性质与XYNB酶学性质有较大差异。综合这些因素,可证明xynB1为新基因。此序列已被EMBL收录,收录号:AJ292317。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q936

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