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《中国农业科学院》 2002年
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高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究

姚江  
【摘要】: 本论文对拥有自主知识产权(专利申请号:01108274)的Bt菌Ly30株进行了系统的研究。首先从形态学水平上确定该菌株杀虫晶体蛋白组分及多种形态的伴孢晶体,进而确定其杀虫谱及毒力高低,然后深入到分子水平,鉴定了ICPs基因的种类,并对ICPs基因进行克隆、表达及生物活性测定。主要结果如下: 1.电镜观察Ly30株拥有大菱形、小菱形、方形、不规则形以及镶嵌形等多种形态的伴孢晶体。SDS-PAGE检测其至少拥有2种蛋白组分,分子量分别为135-140kDa和60kDa,也有弱的85kDa和70kDa蛋白表达。生测结果显示,该菌株不仅对小菜蛾、棉铃虫等鳞翅目昆虫有较高的毒力,其LC50分别为0.022 μg/ml和2.252μg/ml,而且还对直翅目、双翅目昆虫表现一定的毒效,如对黄胫小车蝗(Oedaleusinfernalis de Saussure)的校正死亡率为81.82%,对尖音库蚊(Culex pipiens Linnaeus)的LC50为19.8μg/ml。Bt菌株对直翅目昆虫有毒效未见国内报道。 2.CAPS系统鉴定该菌株至少拥有5种cry基因。采用完全酶切或部分酶切建质粒库、PCR粘端定向克隆等方法,分离克隆了5种cry基因,并进行了序列测定。在GenBank中登记,并获得国际Bt杀虫蛋白命名委员会的正式命名,分别为cry1Aa12(AF384211)、cry1Ac14(AF492767)、cry1Ia9(AF521013)、cry2Aa10(AF433645)和cry2Ab5(AF389442)。序列分析表明与已发表基因的氨基酸序列最高同源性分别为100%,99%,99%,100%和99%。 3.完成了cry1Aa12、cry1Ac14、cry1Ia9和cry2Ab5基因在E.coli受体菌中的高效表达,以及cry2Aa10基因在Bt无晶体突变株中的表达,后者可形成典型的方形晶体。 4.生物活性测定表明,Cry1Aa12、Cry1Ac14蛋白对鳞翅目昆虫具有较强的毒力(如Cry1Aa12蛋白对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾的LC_(50)分别为0.554μg/ml、3.504μg/ml和3.276μg/ml),是菌株对鳞翅目昆虫高毒力的主要体现者。首次鉴定了Cry2Aa10蛋白对黄胫小车蝗有活性(校正死亡率69.73%);Cry2Aa10、Cry2Ab5蛋白对尖音库蚊幼虫有活性(其LC_(50)分别为10.7μg/ml、8.3μg/ml)。 中国农业科学院博土学位论文2002 5.禾用重叠PCR技术,获得c州a10操纵元内o呐、of’fi、o功+o昨和p hi 基因的融合片段,以 pHT3构建原核表达载体 pFU…I’fi+ZAbX pFU(oy+ZAb) 和PFU…功+O吵+ZAb卜结果表明,Orfl及其上游启动子可帮助CryZA hi基因表达, Oof和 Oyt同时存在不仅有助于 CryZA bs表达,还能帮助形成规则方形晶体,具 有分子伴侣khapTone)的作用。 6.HITmp Q柱层析分析结果表明,各基因产物均表现为一定特征的紫外吸收峰,可 作为分离和鉴定 ICPS蛋白的参考。另外,初始菌株 BiLy30和各基因产物吸收峰 之间具有较高的一致性,从而在蛋白表达的层面上证明了各基因的存在。 7.通过离心超滤和热处理,结合生物测定,初步证实BiLy30菌株培养物上清液中 还能产生耐热的增效物质,其增效作用因不同基因产物而异。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S476.1

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【引证文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘旭光;苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究及应用[D];中国农业科学院;2004年
2 张何;苏云金芽孢杆菌4.0718菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆及表达研究[D];湖南师范大学;2003年
3 薛建丽;苏云金芽孢杆菌CrylAa、CrylC的协同作用和同源重组的研究[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2004年
4 任莹博;苏云金芽孢杆菌cry基因克隆表达和质粒复制区克隆的研究[D];河北农业大学;2003年
5 张怀江;苏云金芽孢杆菌cry2Ac基因的克隆及其特性的研究[D];河北农业大学;2005年
6 陈宇熹;高效杀蚊苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29的发酵优化[D];福建农林大学;2010年
7 谢宇飞;苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定[D];福建农林大学;2010年
8 魏蒂;PCR法鉴定苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫晶体蛋白基因[D];中国科学院武汉病毒研究所;2001年
9 伍赠玲;苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位[D];福建农林大学;2004年
10 郑大胜;苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选及DL-5789菌株的研究[D];中国科学院武汉病毒研究所;2001年
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