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《中国农业科学院》 2002年
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美洲商陆抗病毒蛋白基因克隆、表达和遗传转化研究

陈定虎  
【摘要】: 从美洲商陆(Phytolacca americana)叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了完整的总RNA,经RT-PCR分别扩增出全长的及缺失突变型PAP基因,将该基因与克隆载体pGEM-T Easy相连接,从SP6和T7两端同时对其进行序列测定,结果发现该序列与国外报道的PAP基因序列仅有一个碱基的差别,其同源性达99.9%:同时将PAP基因克隆到原核表达载体pET-5a上,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)-plysS,在0.4mM IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,只有N,C端皆缺失的PAP基因在大肠杆菌中得到了特异性表达,表达蛋白大小为27Ku,与预期值相符;Western-blot分析表明该表达蛋白与法国PAP抗血清有特异反应,琼脂双扩散免疫沉淀法鉴定试验证明,表达蛋白与其自己的抗血清及法国的PAP抗血清均能形成免疫沉淀线,且这两条沉淀线在相交处呈融合状态,说明原核表达的该蛋白与法国研究人员从商陆叶片中提取出的PAP具有高度的同源性,也说明本实验准确克隆到了PAP基因并在大肠杆菌中得到了正确表达。 将缺失型PAP基因克隆到植物表达载体pBI121中,通过液氮冷冻法将重组质粒转入农杆菌LBA4404细胞中,然后采用叶盘法,在该农杆菌的介导下将PAP基因导入普通烟草中,经过卡那霉素抗性筛选,最后获得了转PAP基因的工程烟草植株,摩擦接种烟草花叶病毒(TMV),与非转基因烟草相比,能够推迟症状表现达2月之久,说明PAP基因能够在其它植物体内产生有活性的高抗病毒的蛋白质。 通过花粉管通道法将PAP基因导入小麦,收获了转基因小麦种子320粒,将其播种,返青后,直接用麦二叉蚜将大麦黄矮病毒(BYDV)GAV株系接种到幼苗叶片上,观察发病情况。实验结果显示有33株小麦发病程度明显减轻,经分子检测其中有7株含有PAP基因,转化率为2.2%。 为了解决玉米矮花叶病害的防治问题,采用花粉介导法及基因枪法将PAP基因分别导入玉米的杂交种及自交系,获得了10株转基因玉米,PCR及Southern-blot检测结果表明PAP基因已经整合到了玉米基因组中,并且其中有一株PAP基因已经得到了表达,病毒抗性鉴定表明转基因玉米能明显推迟玉米矮花叶病害症状的表现。 棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)一直是棉花生产中难以解决的主要病害之一,由于PAP对真菌也有很好抑制作用,因此,将PAP基因借助微量注射法导入了 中国农业科学院博土学位论义 棉花。为了便于转基因棉花后代的筛选,在 PAP基因的 3’端融入了绿色荧光蛋白GFP) 基因,然后将融合基因克隆在植物表达载体PBI 121上,再进行遗传转化,得转基因 棉花种子5000余粒,将种子播种长到于叶展开时,先在黑暗中用紫外灯照射,查找 表现绿色荧光的幼苗,然后再用地高辛(DIG)标记的PAP基因特异性探针对这些棉 花进行点杂交,最后发现有8株棉花表现阳性反应,说明PAP基因的确己经转到了棉 花的基因组中,其棉花黄萎病的抗性鉴定正在进行之中。 将缺失型PAP基因克隆于酵母分泌型表达载体PPICgK构成重组载体,然后导入 毕赤酵母(P8chia nastoris)菌株GSlls细胞中,在甲醇的诱导下,经过酵母高密度 发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析,结果表明,在培养基上清液中含有一明显 的特异性蛋臼条带,大小为34Ku,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗 血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对TMV的侵染性具有高度的抑制性,说 明该 PAP基因在毕赤酵母 GS中也得到了正确表达。
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