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《中国农业科学院》 2002年
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棉铃虫Bt毒素受体蛋白生化特性、基因克隆及其与抗性的关系

梁革梅  
【摘要】: 棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是世界性重要农业害虫。随着转Bt基因棉花种植面积的快速增长,棉铃虫对Bt的抗性问题不容忽视。棉铃虫对Bt抗性机制的研究是抗性风险预测、抗性治理的基础,对于合理使用Bt、延长转Bt基因棉花的使用寿命具有重要意义。本论文在获得棉铃虫抗性品系的基础上,比较了棉铃虫对Bt抗性水平的检测方法、明确了棉铃虫对Bt产生抗性后繁殖和后代存活能力的变化,分离和纯化了棉铃虫中肠Bt毒素受体蛋白APN,克隆并分析了3类5个编码APN的基因序列,研究了棉铃虫抗、感品系BBMV与Cry1A毒蛋白的结合动力学,填补了我国研究棉铃虫对Bt抗性机制的空白。主要结果如下: 经室内46代筛选,棉铃虫对Bt杀虫剂、Bt毒蛋白和转Bt基因棉已经产生抗性,相对抗性倍数分别为1083.33、417.00和48.67倍。通过测定取食转Bt基因棉花后幼虫的死亡率,可以比较抗性水平较低的棉铃虫品系的差异;当抗性水平较高时,转Bt基因棉花只能做定性检测、不能做定量检测。体重抑制法能科学合理的体现棉铃虫对Bt的敏感性。 棉铃虫对Bt产生高水平抗性后,与敏感品系相比,取食含Bt杀虫剂饲料的幼虫存活率、体重明显增加,但成虫的交配率、产卵量明显降低,产卵期缩短,卵孵化率降低。杂交的抗、感品系成虫交配率、产卵量比抗性品系自交时明显增加,产卵期延长,卵孵化率增加,幼虫存活率比敏感品系明显增长。 利用Mg/EGTA方法,以不同的速度进行离心,可以成功地分离棉铃虫中肠BBMV,且BBMV中保留了大部分APN活性。CHAPS可以增加BBMV的溶解,PI-PLC能将APN从膜上解离下来,Mono-Q和FPLC结合的方法可以纯化部分APN。Western杂交证明棉铃虫中肠BBMV上结合Cry1Ac的主要是120和170kDa的蛋白,并且120 kDa蛋白是通过GPI锚定的APN。通过配体杂交试验,得到~(125)I-Cry1Ac与BBMV杂交的120kDa条带,再次确认这个120kDa的APN是Cry1Ac的受体蛋白。 利用~(125)I标记Bt毒蛋白,测定了棉铃虫抗、感品系幼虫中肠BBMV与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac结合动力学的差异。通过饱和性测定、同源、异源竞争及分离试验,发现BBMV同Bt毒蛋白的结合与Bt毒性有一定的相关性;APN的活性水 MX 平和抗性没有直接关系;棉铃虫对 CrylAC的抗性产生可能和 BBMV与 Cry1AC的 结合位点数目减少有关;但造成抗性的原因可能不仅仅是受体蛋白,还有其它因 素;推测 Cry1Aa、CrylAb和 CrylAc可能有一个共同的结合位点,另外可能还有 一个与CrylAa结合的位点存在。 通过设计简并引物,以RTPCR结合RACE技术,克隆了5个编码棉铃虫APN 的基因。这些APN的氨基酸序列具有氨肽酶N家族的共同特征。利用邻接法进行 同源性分析,发现己克隆的 5个基因分属三个类群。与敏感品系 APN相比,棉 铃虫抗转 Bt基因棉品系 APN的核昔酸序列有 3处碱基发生了突变,导致了二个 氨基酸的取代;抗 Bt杀虫剂品系 APN的核昔酸序列有 8个碱基发生了突变,导 致了5个氨基酸的取代。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S435.622.3

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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1 王东;棉铃虫(Helicoverpa armigera)对多杀菌素的抗性机理及多杀菌素对其胁迫效应研究[D];山东农业大学;2010年
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10 杨亚军;棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因突变的鉴定与检测[D];南京农业大学;2010年
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4 李红;苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2010年
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6 张献芳;利用半夏凝集素构建内生工程菌及其抗同翅目害虫效果研究[D];华中农业大学;2010年
7 刘鑫;利用分子标记辅助选择培育和评价三种BT基因(CRY1AC、CRY1C~*和CRY2A~*)抗虫水稻[D];华中农业大学;2010年
8 丛胜波;斜纹夜蛾与转基因棉(Cry1Ac)的互作研究[D];华中农业大学;2010年
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10 陈冲;烟粉虱生物型鉴定、抗药性监测、杀虫剂的配方筛选及其增效生化机理研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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7 陈利珍;棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系[D];中国农业科学院;2008年
8 李建友;盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡及相关线粒体蛋白质组学研究[D];南京农业大学;2007年
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1 秦秋菊;转Bt基因棉棉铃虫的发生及抗药性变化[D];河北农业大学;2002年
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7 李光涛;亚洲玉米螟Cry1Ab抗性种群的生物学及其抗性遗传规律研究[D];中国农业科学院;2004年
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10 于宏坤;二化螟Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N和钙粘蛋白基因的克隆及在昆虫细胞系的表达[D];中国农业科学院;2007年
【二级引证文献】
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3 宋萍,潘映红,陆秀君,王勤英,张凤巧;两种纯化苏云金杆菌HD-73毒素蛋白方法的比较研究[J];河北农业大学学报;2005年03期
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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6 徐生海;玉米棉铃虫进入危害高峰期[N];武威日报;2007年
7 通讯员 尚松华;精河县全力防治棉铃虫[N];博尔塔拉报;2008年
8 ;如何提高棉铃虫防治效果[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2008年
9 通讯员 杨奇德 李采弟;疏勒县牙甫泉镇采取措施防治棉铃虫害[N];喀什日报(汉);2008年
10 徐云海;棉铃虫冬防三法[N];中华合作时报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 梁革梅;棉铃虫Bt毒素受体蛋白生化特性、基因克隆及其与抗性的关系[D];中国农业科学院;2002年
2 苏建亚;棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子机理及抗性基因分子检测技术[D];南京农业大学;2004年
3 任晓霞;棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)对有机磷杀虫剂靶标抗性机制的研究[D];南京农业大学;2002年
4 吕昭智;棉铃虫网络监测预警信息系统关键技术的研究[D];中国农业大学;2004年
5 周晓梅;棉铃虫对转Bt基因棉抗性的分子遗传机理[D];南京农业大学;2004年
6 郑明奇;棉铃虫细胞色素P450的诱导、纯化及其性质研究[D];中国农业大学;2003年
7 陈利珍;棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系[D];中国农业科学院;2008年
8 杨亚军;棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因突变的鉴定与检测[D];南京农业大学;2010年
9 王桂荣;棉铃虫气味结合蛋白的分子结构及对气味的识别[D];中国农业科学院;2002年
10 陈凤菊;棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶的诱导表达及其基因克隆[D];中国农业大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 常洪雷;棉铃虫Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N1基因克隆及其在昆虫细胞系的表达[D];中国农业科学院;2006年
2 高宇;棉铃虫Cry1A新受体蛋白的鉴定及与抗性的关系[D];东北林业大学;2010年
3 陈法军;蛹期土壤水分状况对棉铃虫生长发育和繁殖的影响[D];南京农业大学;2001年
4 何丹军;检测棉铃虫对Bt基因的抗性等位基因频率及建立新的检测方法[D];南京农业大学;2000年
5 秦秋菊;转Bt基因棉棉铃虫的发生及抗药性变化[D];河北农业大学;2002年
6 杨燕涛;降雨对棉铃虫化蛹和羽化的影响机制及对发生程度的抑制作用研究[D];南京农业大学;2000年
7 魏巍;棉铃虫几丁质酶cDNA克隆及表达研究[D];中国农业科学院;2002年
8 吕梅;棉铃虫对丙溴磷的抗性风险、机理及遗传研究[D];南京农业大学;2004年
9 罗术东;Cry1Ac抗、感棉铃虫中肠BBMV分离、纯化及其与Cry1A的结合模型[D];湖南农业大学;2004年
10 张欣;棉铃虫甾醇载体蛋白2(SCP-2)基因的鉴定和功能研究[D];华中师范大学;2010年
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