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棉铃虫Bt毒素受体蛋白生化特性、基因克隆及其与抗性的关系

梁革梅  
【摘要】: 棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是世界性重要农业害虫。随着转Bt基因棉花种植面积的快速增长,棉铃虫对Bt的抗性问题不容忽视。棉铃虫对Bt抗性机制的研究是抗性风险预测、抗性治理的基础,对于合理使用Bt、延长转Bt基因棉花的使用寿命具有重要意义。本论文在获得棉铃虫抗性品系的基础上,比较了棉铃虫对Bt抗性水平的检测方法、明确了棉铃虫对Bt产生抗性后繁殖和后代存活能力的变化,分离和纯化了棉铃虫中肠Bt毒素受体蛋白APN,克隆并分析了3类5个编码APN的基因序列,研究了棉铃虫抗、感品系BBMV与Cry1A毒蛋白的结合动力学,填补了我国研究棉铃虫对Bt抗性机制的空白。主要结果如下: 经室内46代筛选,棉铃虫对Bt杀虫剂、Bt毒蛋白和转Bt基因棉已经产生抗性,相对抗性倍数分别为1083.33、417.00和48.67倍。通过测定取食转Bt基因棉花后幼虫的死亡率,可以比较抗性水平较低的棉铃虫品系的差异;当抗性水平较高时,转Bt基因棉花只能做定性检测、不能做定量检测。体重抑制法能科学合理的体现棉铃虫对Bt的敏感性。 棉铃虫对Bt产生高水平抗性后,与敏感品系相比,取食含Bt杀虫剂饲料的幼虫存活率、体重明显增加,但成虫的交配率、产卵量明显降低,产卵期缩短,卵孵化率降低。杂交的抗、感品系成虫交配率、产卵量比抗性品系自交时明显增加,产卵期延长,卵孵化率增加,幼虫存活率比敏感品系明显增长。 利用Mg/EGTA方法,以不同的速度进行离心,可以成功地分离棉铃虫中肠BBMV,且BBMV中保留了大部分APN活性。CHAPS可以增加BBMV的溶解,PI-PLC能将APN从膜上解离下来,Mono-Q和FPLC结合的方法可以纯化部分APN。Western杂交证明棉铃虫中肠BBMV上结合Cry1Ac的主要是120和170kDa的蛋白,并且120 kDa蛋白是通过GPI锚定的APN。通过配体杂交试验,得到~(125)I-Cry1Ac与BBMV杂交的120kDa条带,再次确认这个120kDa的APN是Cry1Ac的受体蛋白。 利用~(125)I标记Bt毒蛋白,测定了棉铃虫抗、感品系幼虫中肠BBMV与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac结合动力学的差异。通过饱和性测定、同源、异源竞争及分离试验,发现BBMV同Bt毒蛋白的结合与Bt毒性有一定的相关性;APN的活性水 MX 平和抗性没有直接关系;棉铃虫对 CrylAC的抗性产生可能和 BBMV与 Cry1AC的 结合位点数目减少有关;但造成抗性的原因可能不仅仅是受体蛋白,还有其它因 素;推测 Cry1Aa、CrylAb和 CrylAc可能有一个共同的结合位点,另外可能还有 一个与CrylAa结合的位点存在。 通过设计简并引物,以RTPCR结合RACE技术,克隆了5个编码棉铃虫APN 的基因。这些APN的氨基酸序列具有氨肽酶N家族的共同特征。利用邻接法进行 同源性分析,发现己克隆的 5个基因分属三个类群。与敏感品系 APN相比,棉 铃虫抗转 Bt基因棉品系 APN的核昔酸序列有 3处碱基发生了突变,导致了二个 氨基酸的取代;抗 Bt杀虫剂品系 APN的核昔酸序列有 8个碱基发生了突变,导 致了5个氨基酸的取代。


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