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鸡传染性贫血的流行病学、病毒分离及其VP2基因表达的研究

李刚  
【摘要】: 本试验应用聚合酶链式反应(PCR),酶联免疫吸附试验(ELISA)以及测量血细胞压积值(HCT)的方法对中国东北三个省份进行了鸡传染性贫血病(chicken infectious anemia,CIA)的流行病学调查。结果各代次有鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)检出的鸡场占被检鸡场的比例分别是:祖代50.0%,父母代80.0%,商品代93.7%。 将来自现地疑为CAV感染的病鸡肝脏处理后,接种1日龄SPF雏鸡,14日后,实验鸡采血测量血细胞压积值(HCT),剖检,并将发病鸡肝脏处理后接种MDCC-MSB1细胞。HCT,PCR以及间接免疫荧光试验(IFA)等实验结果显示我们分离到一株CAV病毒,命名为J0105株。 本研究根据已发表的CAV Cux-1株序列,设计了两对引物,从CAV J0105株感染的鸡肝脏中提取总DNA为模板,应用PCR方法扩增了两段DNA片段。将片段分别克隆到PMD18-T载体质粒中,并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,我们得到了J0105株全基因组序列,其基因高度保守,与Cux-1株,SJ1株以及荷兰弱毒株核苷酸同一性分别为97.8%,97.0%和96.6%。 根据文献报道又设计了一对扩增J0105株VP2基因的引物,将PCR扩增的VP2基因克隆到PMD18-T载体质粒上。然后经过酶切和连接,分别将VP2基因克隆至原核表达质粒PET-30b和杆状病毒表达质粒pFASTBACHTa,构建了PET30bVP2重组原核表达质粒和pFBHTaVP2重组杆状病毒表达质粒。以pFBHTaVP2质粒转化大肠杆菌DH10BAC感受态细胞,得到重组转座子rBacmidVP2。将重组转座子与脂质体共转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。 将PET30bVP2和rBacVP2分别在大肠杆菌BL21株和sf9昆虫细胞中进行表达。SDS-PAGE电泳分析表明两种系统均成功表达了含VP2的重组蛋白。Western blot分析显示原核表达产物没有抗原性,而真核表达产物具有抗原性。 本研究为CIA的防制,诊断以及CAV基因工程疫苗的研制打下理论和实践基础。


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