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《中国农业科学院》 2003年
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嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫活性相关分子机制

刘峥  
【摘要】: 致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)细菌是一类与昆虫病原线虫共生的细菌,在20世纪90年代才确定其在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的分类地位。1998年首次报道从发光光杆状菌(P.luminescens)W14菌株中分离到口服杀虫活性毒素蛋白基因,从此对该类细菌杀虫蛋白基因的研究成为本领域的热点。同时,共生细菌代谢物对害虫的杀虫和抑制生长活性也引起了新型微生物农药研究者的兴趣。为更好地开发昆虫病原线虫共生细菌这一新型杀虫微生物资源,有必要开展此类细菌杀虫活性相关分子机制的研究,国际上此类研究尽管活跃,也还处在起步阶段,国内尚未见有关此类细菌杀虫活性分子机制方面的研究报道。本研究在对30株共生细菌的杀虫活性进行生物测定的基础上,以研究组在北京郊区土样中分离到的小卷蛾斯氏线虫的共生细菌——嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)CB6菌株为主要研究对象,利用PCR和AFLP指纹图谱分析等分子生物学技术,对嗜线虫致病杆菌CB6菌株的杀虫活性相关分子机制进行了研究。主要研究结果如下: 1) 对30株不同种共生细菌发酵液的口服杀虫活性测定结果表明,供试的大多数菌株对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和菜青虫(Pieris rapae)幼虫具有一定的致死、抑制生长和拒食活性;不同种共生细菌杀虫活性不同,其中嗜线虫致病杆菌杀虫活性较高,对棉铃虫初孵幼虫的致死率为89.3%;同一菌株对不同龄期的昆虫毒性亦不同,嗜线虫致病杆菌CB6菌株对棉铃虫初孵幼虫的致死率为88.7%,对3龄幼虫的生长抑制率为95.1%,对5龄幼虫的拒食活性为83.6%。 2)利用特异引物从杀虫活性不同的4个菌株CB6、CB33、CB43和CB54中扩增到杀虫基因片断cb6A1、cb33A1、cb43A1和cb54A1,它们的核苷酸序列具有高度的同源性。并且发现在cb43A1、cb54A1的1038位点缺失1个碱基—鸟嘌呤G,造成移码突变。杀虫蛋白基因内部的点突变,可能是不同菌株杀虫活性不同的原因之一。 3)构建了嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫蛋白基因片断cb6A1的非融合表达载体pBV221-cb6A1-1和融合表达载体pGEX-KG-CB6A1-2,并在大肠杆菌中获得表达,用含有非融合表达蛋白的人工饲料(20μg重组蛋白/g饲料)饲喂棉铃虫初孵幼 虫,3天后幼虫死亡率为91.盯%,证明CMI杀虫蛋白基因片断表达蛋白具有一定 的杀虫活性。 4)通过对m6菌株I、I工型菌注射和日服杀虫活性的测定,证明I型菌比厂型 菌具有较高的杀虫话性。以Cn6菌株为材料,首次对I、门型茵mS,RNA序列和 杀虫蛋白基回片断序列进厅对比,发现I、工工型菌m厂MA序列存在差异,两者 的同源性为99.8弧,而杀虫蛋白基回片断的核昔酸序列完全相同。 5 ) 利用 AFLP技术对 CB6茵株 I、11型菌基因组MA进行指纹图谱分析,获得了 8个I、11型菌DNA—AFLD差异片断。Ge。fis。k同源比对表明,其中7个基回片断 在致病杆菌属(丫e。O厂人。b加 和光杆状菌属(尸hO ZO。h。b巾lJ细菌中为首次分离。推 测的氨基酸序列分析表明,这8个差异基因片断是与细菌转录调节、能量代谢和 膜蛋白生物合成及功能相关的基回片断。Ge。BaJ止 登录号分别为AY317150, AY:317151,AY317152,AY317153,AY321438,AY321439,AY321440,AY321441。 这一结果发现了同一菌株的卜I工型菌在DNA水平上的差异,表明型态变异的发 生是共生细菌遗传不稳定性的反[l山。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S476.1

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