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《中国农业科学院》 2003年
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高甜度monellin基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中的表达

李敏  
【摘要】: monellin是一种高甜度、低热量、口味纯正、安全无毒的蛋白甜味剂,应用前景十分广阔。但其天然植物来源非常有限,现有的基因工程菌又存在产量低,胞内表达提取困难的问题,从而限制了monellin的规模生产和广泛应用。 本研究拟以拥有自主知识产权的高甜度monellin基因,利用毕赤酵母表达系统,构建高效表达、有效分泌高甜度monellin的重组毕赤酵母生物反应器。以期解决目前monellin基因工程菌存在的单产低、从胞内提取困难的两大难题。同时探讨vgb基因在毕赤酵母中的功能,并应用于高甜度monellin重组酵母,解决毕赤酵母高密度发酵中存在的供氧不足的问题,进一步提高高甜度monellin的产量。 首先,采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M。高甜度monellin的摇瓶表达量约0.25g/L。目前涉及monellin分泌表达的研究报道中,表达产物没有甜味活性。 同时,采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了透明颤菌血红蛋白基因(vgb);并构建了vgb基因的酵母胞内表达载体pPIC3.5KV,通过电击转化获得了能在胞内表达有生物活性VHb的重组毕赤酵母GS115/pPIC3.5KV。这种新型重组菌在贫氧条件下,与现有的毕赤酵母宿主菌相比具有明显的生长优势,更适于高密度发酵和用作表达外源蛋白的宿主。目前尚未见vgb基因在毕赤酵母中表达的研究报道。 进一步通过电击转化将vgb基因整合到重组酵母GS115/pPIC9M的基因组中,获得了由高甜度monellin和vgb两个基因同时整合的重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV。经甲醇诱导,高甜度monellin基因和vgb基因分别以分泌和胞内的形式得到表达,且表达产物均有生物活性。VHb在胞内的成功表达,使重组毕赤酵母高甜度monellin的分泌表达量提高了20%,达0.3g/L。目前尚未见将rgb基因用于提高毕赤酵母中外源蛋白表达的研究报道。 以重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV为出发菌株,通过摇瓶水平发酵条件优化,使高甜度monellin的分泌表达量进一步由0.3g/L提高到了0.5g/L。 以摇瓶发酵条件为依据,在30L发酵罐上采取分批补料的方式实现了重组酵母GS115/pPIC9M/pPIC3.5KV的高密度发酵,高甜度monellin分泌表达量达2g/L。比目前报道的在毕赤酵母中以胞内形式表达的monellin最高表达量1.8g/L还高,而且表达的高甜度monellin分泌到胞外,无需破碎细胞提取。解决了目前甜蛋白基因工程研 中国农业科学院博士学位论文 究中存在的单产低、胞内提取困难的两大难题。 综上所述,本研究成功构建了可高效表达、有效分泌高甜度monellin的重组毕赤 酵母工程菌,探索了一种利用…基因解抉毕赤酵母高密度发酵中氧气供求矛盾。提 高毕赤酵母中外源蛋白产量的新方法,提供了一条产量高、分离纯化简便,可低成本 大规模生产高甜度monellin的新途径。为实现高甜度monellin的产业化和 vgb基因在 毕赤酵母高密度发酵中的广泛应用奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q786

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【引证文献】
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