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《中国农业科学院》 2003年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建及其免疫效力评价

薛强  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪发生繁殖障碍和仔猪出现呼吸道症状为特征的传染性疾病。根据基因型差异,PRRSV可分为北美洲型(VR-2332为代表株)和欧洲型(LV为代表株)。因PRRSV侵害免疫系统而且易发生变异,常规的疫苗策略难以产生理想的效果,所以,研制安全而有效的基因工程疫苗具有重要的意义。 根据PRRSV结构蛋白各自在诱导猪体产生免疫应答中的特性,以真核表达质粒pIRES1neo(CLONTECH)为骨架,设计构建了一系列针对PRRSV的双基因表达载体:pIRESorf5/4(含有PRRSV ORF4和ORF5)、pIRESorf6/5(含有PRRSV ORF5和ORF6)、pIRESorf7/5(含有PRRSV ORF5和ORF7),并构建了含有猪细胞因子编码基因的重组质粒pIRESorf5/IFN_γ(含有PRRSV ORF5和猪IFN_γ基因)、pIRESorf7/IFN_γ(含有PRRSV ORF7和猪IFN_γ基因)、pIRESorf5/IL-2(含有PRRSV ORF5和猪IL-2基因)和pIRESorf7/IL-2(含有PRRSV ORF7和猪IL-2基因)。 经IIF检测和小鼠预试验,确证了这些重组质粒可以表达。将30头PRRSV阴性小猪分为10组,其中一组作为空白对照,其余组分别接种重组质粒pIRESorf5/4、pIRESorf6/5、pIRESort7/5、pIRESorf5/IFN_γ、pIRESorf7/IFN_γ、pIRESorf5/IL-2、pIRESorf7/IL-2、灭活苗和空质粒pIRES1neo。我们以PRRSV CH-1a株主要结构基因ORF4、tORF5(truncated ORF5)、ORF6和ORF7的原核表达产物rGP4、rtGP5、rM和rN蛋白作为抗原,对接种动物进行了血清学检测。经过两次免疫后,大部分带有PRRSV ORF7的重组质粒都诱导猪体产生了针对PRRSV N蛋白的ELISA抗体和Western Blotting抗体。而带有PRRSV ORF4、ORF5或ORF6的重组质粒诱导猪体产生抗体的速度较慢,ELISA抗体滴度较低,有的动物在4次免疫后都没有检测到 博士学位论文 中文拘要 中国农科院研究生院 ELrsA抗体。但是经4次免疫后,全部检测到了 Western Blotting抗体。在检测中, 所有 ELISA抗体阳性的动物在 Western Blotting检狈中都呈阳性,W且 Western BI0tting 抗体的出现要早于EL旧A抗体。 PRRSV的感染一般为亚临床表现,在本试验中,攻毒后所有的小猪都没有出 现呼吸困难、耳朵发兰等症状,但空白对照猪和空质粒接种猪的体温要高于基因 疫苗免疫猪和灭活苗免疫猪,最高可达 40石 C。 在对外周血淋巴细胞中n4+、CDS+及CD4VCDS+了细胞亚类的动态监测中, 实验动物表现出极大的差异。与空白对照组和空质粒p旧ESineo免疫组比较,各 重组质粒免疫组动物的CD4+、C08+及CD4+IC08+T细胞有不同程度的升高。攻毒 后 *旧ESOrfsl4*旧ESOrf6/5、p旧ES0rf715、p旧ESOrf7llFNY、pIRES0rfsllLZ和p旧ES100O 免疫组动物均呈现为cD个丁细胞含量稳步上升,而卯8+了细胞含量一过性上升后 很快就下降,这和文献报道的不同。 尽管攻毒后动物没有表现出明显的呼吸道症状,但在剖检后发现在肺脏有不 同程度的病理变化,主要表现为粉红色肉样变和灰色肝样变,显微镜下观察表现 为!白]质性肺炎和小叶性肺炎病变。空白对照组动物病变严重。在疫苗接种组中, p旧ES0rfsllFNY免疫组中有2头猪(213),p旧ESOrfsl儿-2免疫组(113)、p旧ES。rf71几-2 (1/3)兔疫组和灭活苗免疫组(112)中各有 1头猪肺脏完全正常,没有病变。 在对实验动物主要脏器中病毒粒子含量的检测中发现,基因疫苗和灭活苗都 没能阻止PRRSV病毒血症的发生尸RRSV病毒粒子在大多数动物脏器中都有分布。 但病毒粒子在不同动物、在动物不同脏器中的含量却差异较大。与对照组相比, 基因疫苗在一定程度上抑制了病毒的复制。 综合各项指标,这些基因疫苗都能诱导机体产生抗PRRSV的抗体,在抗病毒 免疫中能够发挥一定的作用,但与常规疫苗一样,并不能高效杀灭病毒粒子,阻 止病毒血症的发生。而且不同的基因疫苗在诱导机体免疫应答、在机体的抗病毒 作用中表现出不同的效能。基困疫苗中的细胞因子在抗病毒免疫、保护机体兔受 入侵病毒的损害中发挥了重要作用。 本试验对 PRRSV主要结构基因在抗 PRRSV免疫应答中的作用进行了研究, 并检测了细胞因子在免疫应答中的增强作用。这些数据将为今后PRRSV疫茵,特 别是基因工程疫苗的研制提供借鉴。 PRRSV嗜好在PAM和其他单核细胞上生长,如果把PRRSV作为一种病毒活 2 薛强 猜鳖殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建及其免疫效力评价2003年6月 载体,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的兔疫系统,更好地刺激机体产生免 疫应答。而作为病毒活载体,必须是弱毒,而且能够进行体外操作。PRRSV为RNA 病毒,在体外难于进行基因操作。运用反向遗传操作技术,将基因组RNA转换为 CDNA,在DNA水平上就易于对病毒进行基因操作。感染性分子克隆是RNA病毒 反向遗传操作的技术平台。 根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性酶切位点,将PRRSV基因组分为8 段进行
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
2 周艳君,童光志,薛强,仇华吉,王云峰,赵永刚,王玫;猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用[J];中国预防兽医学报;2002年06期
3 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力;猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定[J];中国兽医学报;1998年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴家强,颜世敢,胡北侠,任素芳,黄艳艳,张秀美;细胞培养对PRRSV-SD分离株滴度的影响[J];山东农业科学;2002年06期
2 金光明,杨倩;猪繁殖与呼吸综合症免疫学研究[J];安徽农业科学;2003年01期
3 梁望旺;杨克礼;伍锐;刘泽文;熊忠良;徐涤平;;猪繁殖与呼吸综合征病原学研究进展[J];安徽农业科学;2007年36期
4 卢高峰;夏平安;邱璜;李伟娟;王中明;刘明莉;;PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建[J];安徽农业科学;2008年26期
5 隋慧;杨金生;;猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力[J];安徽农业科学;2009年11期
6 刘成倩;肖长峰;易建中;关平原;吴双林;陈斌;张天庆;;猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达[J];安徽农业科学;2009年22期
7 尹国友;孙婕;陈兰英;赵祯;;猪繁殖与呼吸综合症流行株ORF_5基因遗传变异分析[J];安徽农业科学;2010年08期
8 蔡锦顺;李珈莹;马永和;扈荣良;张嘉保;;PRRSV GP5与GP4蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究[J];安徽农业科学;2010年10期
9 刘长龙;李燕华;袁世山;;用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用[J];安徽农业科学;2010年23期
10 韦英益;廖素环;李爱友;曾芸;李跃华;袁紫云;宁均淼;黄伟坚;;猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA毒株人工感染仔猪的病理学研究[J];安徽农业科学;2011年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冷超粮;安同庆;田志军;;猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 唐娜;曲光刚;王金良;苗立中;肖跃强;张倩;沈志强;;山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传特性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 孔宁;高继明;马玉萍;赵钦;王承宝;肖一红;周恩民;;高致病性PRRSV感染处于不同细胞周期Marc-145细胞的比较分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];第十届中国科协年会论文集(三)[C];2008年
5 甘燕;吴少庭;秦莉;潘晖榕;戴五星;袁仕善;黄达娜;;SARS冠状病毒E蛋白DNA疫苗的构建及其实验免疫研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
6 张利娜;张改平;唐志鹏;温建新;席俊;;PRRSV ORF6基因的克隆与真核表达载体的构建[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
7 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式,促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年
8 王选年;张改平;席俊;保银梅;唐海蓉;李敬玺;王新华;;IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
9 童光志;田志军;;猪生殖与呼吸道综合征疫苗研究进展[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
10 王旭荣;宋长绪;王贵平;杨增岐;祝卫国;张春红;黄忠;;PRRSV ORF3、ORF5串连基因重组腺病毒的构建[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
2 李红;CD163及其它蛋白在PRRSV感染细胞过程中的相互作用[D];山东农业大学;2011年
3 邢凤;猪抗PRRSV相关基因的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2011年
4 张德庆;C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D];山东农业大学;2011年
5 王刚;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染所致的免疫损伤及免疫调控机理[D];山东农业大学;2011年
6 周奇;核酸疫苗免疫增强策略及其诱导免疫损伤的机制研究[D];第二军医大学;2011年
7 姜举娟;PRRSV HuB1株的分离鉴定及甘草酸体外抗PRRSV感染的研究[D];东北林业大学;2010年
8 郝晓芳;甘肃省猪繁殖障碍性疾病病毒性病原的分子流行病学调查及HP-PRRSV DNA疫苗的研究[D];中国农业科学院;2011年
9 陆嘉琦;猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非翻译区的结构与功能解析[D];中国农业科学院;2011年
10 周丹;猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株核酸疫苗的研究及免疫效果比较[D];四川农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋飞;猪圆环病毒2型(WH株)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染致病性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 李燕;猪干扰素刺激基因ISG20的克隆、真核表达及其对PRRSV增殖的影响[D];华中农业大学;2010年
3 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
4 肖犟;PRRSV对断奶仔猪生产性能和免疫力相关指标的影响[D];华中农业大学;2010年
5 王艳伟;PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究[D];华中农业大学;2010年
6 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
7 史平玲;猪FcγRⅢ介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];郑州大学;2010年
8 孟祥珍;潍坊地区猪“高热病”流行病学调查和防控[D];山东农业大学;2009年
9 薛梅;潍坊地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
10 张金强;山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒感染状况调查与遗传变异分析[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
2 仇华吉,童光志,郭宝清,王柳,张绍杰,王玫,于力,刘宝全;猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株N基因的分子克隆、序列测定及其比较分析[J];中国畜禽传染病;1998年04期
3 王云峰,仇华吉,周彦君,张绍杰,郭宝清,倪健强,童光志;PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达[J];中国兽医学报;2000年05期
4 王云峰,周艳君,仇华吉,钱平,蔡雪晖,柴文君,童光志;应用重组N蛋白-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究[J];中国兽医杂志;2001年03期
5 张鹤晓,王刚,王彩兰,崔向东,苏世敏,于文军,张玉忠;应用间接免疫荧光试验从猪群中检测出PRRS抗体[J];中国兽医杂志;1996年11期
6 王刚,张鹤晓,甘孟侯,张玉忠,王彩兰,崔向东,苏世敏,张兆平,姜永庄;IPMA检测猪生殖和呼吸综合征病毒抗体的研究[J];中国兽医杂志;1996年12期
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1 高志强,郭鑫,杨汉春;猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展[J];中国农业科技导报;2002年06期
2 贾赟,张素芳,周斌,郑其升,赵玉军,陈溥言;猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的快速检测及地域流行性分析[J];中国病毒学;2004年05期
3 潘杰;沈明君;范娟;徐蓁;刘宏斌;贾雪波;傅元华;;猪繁殖与呼吸综合征病毒超滤浓缩对其TCID_(50)的影响[J];畜牧与兽医;2009年05期
4 罗俊;刘业兵;宁宜宝;陈坚;;猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ株、GD株全基因组序列测定与分析[J];西北农业学报;2010年01期
5 乐敏,陈焕春,邱德新,钱平;猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2004年03期
6 李华,杨汉春,郭玉璞;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的免疫学研究进展[J];中国兽医杂志;1999年09期
7 李玉峰,王先炜,姜平;上海地区出现猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒混合感染[J];中国兽医学报;2003年05期
8 李玉峰;姜平;蒋文明;汤景元;;猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性测定[J];中国病毒学(英文版);2006年04期
9 金光明,王珏,宁康建,吕锦芳,李升和,应如海;PRRSV弱毒细胞疫苗与灭活疫苗生殖道黏膜免疫效果观察[J];中国农学通报;2005年03期
10 邱昌庆;猪PRRSV美国株的结构多肽[J];畜牧兽医科技信息;1997年20期
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1 程俊贞;刘光辉;赵雪丽;;猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
2 薛强;刘光清;仇华吉;蔡雪辉;童光志;;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因组全序列测定及感染性转录本的体外构建[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
3 魏宏;林锋强;庄向生;周伦江;王隆柏;;猪繁殖与呼吸综合征病毒福州株ORF2-7基因结构分析[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(上)[C];2005年
4 王学兵;崔保安;魏战勇;张润娜;徐端红;杨明凡;;黄芩苷的提取及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究[A];纪念《元亨疗马集》付梓400周年中国畜牧兽医学会中兽医学分会2008年学术年会华东区第十八次中兽医科研协作与学术研讨会暨兽药发展论坛论文集[C];2008年
5 蒋文明;姜平;李玉峰;吴胜昔;许家荣;;由减毒沙门氏菌介导的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗的口服免疫应答[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
6 王金凤;张岭岭;王娇;赵泽坤;孙继国;袁万哲;;高致病性PRRSV河北地方株的分离鉴定及部分Nsp2基因变异分析[A];中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2010年
7 韩庆安;朱振荣;张永辉;张子佳;刘红;尹克勇;杨刚;王玉清;;2004~2008年河北省规模猪场PRRSV感染情况调查[A];2010畜牧业与低碳经济科技论文集[C];2010年
8 夏平安;李艳伍;张红英;杨霞;崔保安;卢中华;;猪繁殖与呼吸综合征和猪流感复合RT-PCR诊断方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
9 舒秀伟;陈生雷;周丽;王文成;;中草药提取物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年
10 高恩鹏;李志杰;丁壮;孟轲音;宣华;王贵平;丛彦龙;母连志;;PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因克隆与原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
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1 中牧;PRRSV活疫苗的使用[N];农民日报;2005年
2 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金博士;猪呼吸与繁殖综合征流行特点、危害状况及防制策略[N];中国畜牧兽医报;2005年
3 余木;PRDC和疫苗的效果[N];中国畜牧报;2005年
4 瑞普(保定)生物药业有限公司 李建丽;猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特点及免疫机制[N];中国畜牧兽医报;2009年
5 北京华都种猪繁育有限责任公司 姚亮;现代养猪场的疾病控制方案[N];中国畜牧报;2004年
6 丁壮 万遂如;我国主要猪传染病防治研究进展[N];中国畜牧报;2002年
7 马利;猪繁殖与呼吸综合症的防治[N];中国畜牧水产报;2001年
8 王锡祯 王泽华 俞燕君 关同应;猪呼吸道疾病的现场诊断和防治[N];中国畜牧报;2002年
9 瑞普(天津)生物药业有限公司 李刚 谢雪松;控制商品子猪综合征有效办法初探[N];中国畜牧兽医报;2009年
10 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金 博士;猪呼吸与繁殖综合征流行特点、危害状况及防制策略[N];中国畜牧兽医报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 薛强;猪繁殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建及其免疫效力评价[D];中国农业科学院;2003年
2 任慧英;猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗的研究[D];中国农业大学;2004年
3 马凤龙;PRRSV、PRV的分离、鉴定和主要免疫相关基因的克隆、表达及二联核酸疫苗研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年
4 黄金海;猪繁殖与呼吸综合征病毒N、GP5蛋白的表达、纯化及结构分析[D];中国农业大学;2004年
5 蔡锦顺;PRRSV GP5与M蛋白重组犬2型腺病毒的构建及其免疫特性研究[D];吉林大学;2010年
6 邢凤;猪抗PRRSV相关基因的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2011年
7 高志强;猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析[D];中国农业大学;2003年
8 周铁忠;辽宁省猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学调查及免疫防制研究[D];吉林大学;2010年
9 张磊;感染PRRSV GD株强弱毒株Marc145细胞的差异表达基因筛选及调控研究[D];西北农林科技大学;2011年
10 李广明;靶向PRRSV及其PAM细胞病毒受体基因shRNA重组腺病毒的构建与抑制PRRSV复制研究[D];南京农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 荣福龙;高致病性PRRSV在仔猪体内动态分布和体外增殖特性的研究[D];东北农业大学;2010年
2 宫大庆;高致病性PRRSV HuN4株感染仔猪过程中淋巴结蛋白质组学研究[D];黑龙江八一农垦大学;2011年
3 王美君;临床健康猪群中PRRSV的分离与鉴定[D];山东农业大学;2010年
4 姚雪静;PRRSV安徽株的分离鉴定及感染仔猪病理学的研究[D];安徽农业大学;2010年
5 曹永芝;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的气溶胶传播机制[D];山东农业大学;2010年
6 李珈莹;PRRSV GP4、GP5基因的克隆及原核表达[D];延边大学;2010年
7 张冲;野猪源PRRSV Shaanxi-2株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析[D];西北农林科技大学;2010年
8 赵泽坤;高致病性PRRSV的RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用[D];河北农业大学;2010年
9 廖立珊;PRRSV N基因真核表达、ELISA应用及单克隆抗体的制备[D];湖南农业大学;2010年
10 蒋小红;广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究[D];广西大学;2004年
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