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棉花nodulin-like和arf1基因及其启动子的分离和功能分析

任茂智  
【摘要】:目前植物基因工程广泛应用的启动子是CaMV35S启动子,它驱动外源基因在植物的各种组织和所有发育阶段都会表达。这无疑增加了植株的代谢负担,并造成物质和能量上的巨大浪费。用特异性启动子取代组成型启动子,使外源基因能够定时、定点、定量的在植物中表达是植物基因工程研究的重要内容。因此,本研究的主要目的是:分离鉴定棉花生殖器官优势表达启动子,为外源基因在棉花生殖器官中高效表达提供有用的调控元件,最终为基因工程改良棉花生殖器官的性状提供有用的分子工具。 本研究在反向PCR基础上,建立了一种新型染色体步移技术:同尾酶反向PCR。运用该技术进行染色体连续步移,快速扩增DNA侧翼未知序列。还建立了一套快速定位目的基因转录起始位点的方法,可精确标记转录起始位点的位置,从根本上保证获取的目的基因cDNA和启动子具有高度的完整性和特异性。 利用以上两项技术,从棉花基因组上快速分离到Nodulin-like和ADP-ribosylation factor1(arf1)两个基因的全长DNA、cDNA和启动子。Nodulin-like基因的启动子全长为1193bp,基因全长为2353bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1480bp,含有一个1125bp的ORF结构,编码375个氨基酸。Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。Arf1基因全长为4360 bp,具有6个内含子和7个外显子。Northern blot结果证实该基因在棉花生殖器官中的优势表达。该基因的启动子全长为1629bp。 根据Nodulin-1ike和arf1启动子的结构特征和表达调控元件的分布,分别设计了三个启动子片段缺失突变体,并与GUS基因融合,构建了六个植物表达载体:pBIN1GUS、pBIN2GUS、pBIN3GUS、pBIA1GUS、pBIA2GUS和pBIA3GUS。将这六种植物表达载体用花粉管通道法导入陆地棉品种Y18之中,共获得8.44Kg T_0代种子,经卡那霉素筛选、PCR鉴定和GUS染色,最终获得6个相应类群共47株GUS阳性植株,其中:转pBIN1GUS的13株,转pBIN2GUS的6株,转pBIN3GUS的4株,转pBIA1GUS的14株,转pBIA2GUS的6株,转pBIA3GUS的4株。 对转基因后代进行GUS染色和荧光定量分析结果表明:与CaMV35S::GUS转基因棉株相比,六种启动子的GUS表达活性均高于CaMV35S启动子。其中pBIN3GUS的GUS活性最低,是pBI35SGUS的1.85倍:PBIA1GUS的GUS活性最高,是pBI35SGUS的4.5倍。Nodulin-like基因的核心启动子位于+109—221bp,这段序列决定了该启动子在棉花生殖器官中优势表达的特性:-221—677这段序列包含有增强该启动子在棉花生殖器官中表达强度的调控元件,-677—1084这个区域,能够更进一步提高GUS基因的表达活性。在arf1启动子中,+133—277这段序列包含有决定该启动子在棉花花药、纤维、铃壳中表达的元件:+133—+748这段序列中有决定该启动子在棉花子房、柱头、花丝、铃壳等组织中表达的元件;-277—706中具有增强该启动子表达活性的元件。 本研究为进一步利用这两个启动子在棉花生殖器官中高效表达外源基因和深入研究Nodulin-like和arf1两个基因在棉花生殖器官发育过程中的功能奠定了基础。


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