增强番茄果实颜色基因的精细定位及相关基因的差异表达
【摘要】：番茄果实颜色是重要的品质性状之一，利用野生番茄中增强果实颜色的基因对于果实颜色品质改良具有重要意义。为此国内外研究者展开了广泛的研究，已从野生番茄中鉴定了54个与果实颜色有关的QTL，并建立了主效QTL近等基因系(QTL-NILs)或亚近等基因系(sub-NILs)，例如TA517就是野生多毛番茄(L．hirsutum)LA1777的一个渐参系，以普通番茄E6203为遗传背景含有1个长50cM来自LA1777第4染色体底端的片段，QTL分析表明该片段含有2个明显增强果实颜色的QTL。
本研究在前人研究工作的基础上，以TA517及其近等基因系为主要材料，对其中的2个增强果实颜色的QTL进行了精细定位，并利用cDNA-AFLP方法研究了含有增强果实颜色QTL的材料在果实不同发育阶段基因的差异性表达。目的在于：通过QTL精细定位获得与之紧密连锁的分子标记，增强育种家操作QTL能力，并为QTL的进一步克隆提供理论依据；通过基因差异性表达鉴定和分离与果实颜色相关的基因，研究基因在果实不同发育阶段的表达，并初步探讨QTL影响果实颜色的机制。主要结果如下：
1、进行了能否将潘那利番茄图谱上的分子标记应用到多毛番茄进行遗传分析，并将其转化为易于操作的PCR标记以克服RFLP和COS标记的操作复杂、耗时长、需要放射性步骤和成本高的缺点的尝试，通过对21个RFLP和COS标记的CAPS转化分析，获得了11个可用于多毛番茄的CAPS标记，利用11个CAPS标记对TA517及其近等基因系进行遗传分析，获得了与预期结果一致的多态性，表明RFLP和COS标记可以转化为易于操作、效率高成本低的CAPS标记。
2、利用72个Ecor I／Mse I引物组合对多毛番茄LA1777、TA517及E6203进行了AFLP分析，结果每对引物可以扩增出60～100条分子量为20～600bp的谱带，一共发展了8个AFLP标记，其引物组合及其分子量分别为：E32／M47-180、E32／M59-90、E33／M48-160、E37／M49-290、E38／M47-150、E38／M62-300、E41／M59-140和E41／M60-180，通过连锁分析将8个标记定位于多毛番茄第4染色体底端长度为50cM的片段内。
3、利用CAPS和AFLP标记构建了番茄第4染色体底端长50cM片段的精密分子遗传图谱，该图谱由26个标记组成，其中包括新建立的11个CAPS标记和8个AFLP标记，是原有图谱上的10个标记的2.6倍。图谱覆盖了番茄第4染色体底端长50cM的片段，两个标记之间的平均距离1.92cM。该图谱将为该染色体片段内的质量基因定位、基因组比较研究和重要农艺性状QTL的精细定位奠定基础。
4、对多毛番茄第4染色体底端长50cM片段内的2个增强果实颜色的QTL进行了精细定位，eco14.1增强果实表面颜色，ico14.2增强果实内部颜色，结果将eco14.1定位于标记CT50与E41／M59-140之间，遗传距离为2.0cM，比原有的距离5.5cM缩小了3.5cM。将ico14.2定位于标记CP57和CT173之间，遗传距离为2.3cM。
5、cDNA-AFLP是研究番茄基因差异性表达较为理想的方法，利用该法检测到162个在果实的膨大期、绿熟期、转色期和完全成熟期特异表达的TDF。利用在选择性扩增中相同的引物组合对分子量大于180bp的90个TDF进行了再次扩增、纯化、序列测定和同源性比较分析。结果发现2个TDF与已克隆的基因序列相比同源性较高。TDF-_(TA1465B_E33／M60-460)(来自番茄TA1465的转
色期，利用引物组合E33彻60进行选择性扩增后获得，分子量为460bP)的序列与番茄属(SoIan，
勿cqpersi洲间叶绿体忿尺入叼一eu基因序列的同源性高:TDF一TA，467B一3、60_30。的序列与番茄的透性
酶基因、生长素生长促进子蛋白质、蛋白质磷酸酶和ACC4基因的同源性高。其余TDF和已知
功能基因的序列相比同源性较差，只有19一23个碱基与己克隆的基因序列一致。在含有增强果实
颜色QTLe。。14.1或(和)j。014.2的番茄及对照之间，同源性分析均未检测到含有eco14.1或
(和)工。0] 4.2的番茄材料在果实发育各个阶段特异表达的TDF与类胡萝卜素合成途径有关的酶的
基因有较高的同源性，但与果实颜色密切相关的类胡萝卜素合成途径、乙烯代谢途径、富含亮氨
酸的蛋白质合成途径等高度相关，表明配014.1和jco]4.2不属于类胡萝卜素代谢途径有关的酶
的基因，可能属于调节和控制因子。
6、在cAPs实验中，基于一些 CApS标记分享同一种限制性内切酶的事实，结合Multinlex-PcR
在同一扩增反应中应用不同引物对能同时扩增相应序列的优点，应用MultiPlex一cR和c妙s原理
首次研究建立了MutiPlex-cAPs技术。该技术能同时检测2个、3个或多个c”s标记的多态性，
其效果等同于各个cAPs标记的多态性的叠加，具有重复性好、分析效率高、成本低等优点，可
广泛用于番茄及其它作物快速的遗传鉴定和分子育种中。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S641.2
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