苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究及应用

【摘要】：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的δ-内毒素(或杀虫晶体蛋白)对多个目的害虫具有杀虫活性，其独特的优点在农林害虫的生物防治中得到了广泛的应用。鉴定编码杀虫晶体蛋白的基因(cry基因)，对于发现、分离、克隆特异活性的新基因以及转基因植物和微生物等研究都具有重要意义。 传统的Bt δ-内毒素基因鉴定方法主要是建立在PCR基础之上的，由于自身具有局限性，此类方法已不能适应高通量、大规模、迅速、平行等基因组研究方面的要求，因而目前迫切需要应用一种新的检测方法以适应基因组研究的要求。 基因芯片技术是近年来发展起来的基因组研究技术。现已表明它是在基因组规模上研究基因表达和调控的一种强有力的研究工具，同时也是原核和真核生物功能基因检测与多态性研究的极好方法。虽然人们对基因芯片技术进行了深入的研究，但是目前尚无应用寡核苷酸探针在不进行定向扩增条件下直接检测总DNA中功能基因的相关报导。 本研究中，建立了应用寡核苷酸芯片检测Bt总DNA中cry基因的方法；在应用此方法与生物信息学的基础上，构建并应用了cry1、cry2、cry9基因检测芯片。其主要研究结果如下： 1 Bt cry基因检测芯片关键技术研究 通过对基因芯片中探针长度、浓度、总DNA的含量与处理、标记方法、灵敏度和杂交条件的研究表明，用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40-50mer、40μmol·L~(-1))杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因，从而建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。 研究表明，不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P＜0.01)，而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3小时；检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg；标记产物杂交用量(0.625 to 20μg)的对数值与信号值的对数值之间存在着明显的线性关系(r~2=0.985 to 0.989)。 2 生物信息学在cry基因芯片检测中的应用 针对在线BLAST的不足，建立了Bt cry基因核苷酸序列本地数据库，并在此基础上进行寡核苷酸探针的本地BLAST以确保其特异性。通过与在线BLAST比较，本地BLAST在准确性、冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优于在线BLAST。 根据Bt δ-内毒素基因核苷酸序列的同源性关系，充分应用生物信息学方法设计了用于cry1、cry2、cry9基因检测的寡核苷酸分级探针。 3 cry1、cry2和cry9基因检测芯片的制备与应用 制备了cry1、cry2和cry9基因检测芯片并分析了8个苏云金芽孢杆菌菌株的基因型。结果表明，寡核苷酸芯片检测结果与已知菌株的基因型吻合，与未知基因型的菌株的PCR-RFLP初步鉴定结果也有很高的一致性。