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《中国农业科学院》 2004年
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鸡传染性贫血病毒重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制

王英  
【摘要】:鸡传染性贫血(chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)引起雏鸡的以坏疽、淋巴组织损伤和骨髓发育不全为特征的传染病,是继IBD后的一种重要的免疫抑制性疾病。目前,本病已成为世界性疾病,严重地威胁着养禽业。但在现地,由于并发继发的病毒性、细菌性传染病或球虫病升高了CIA的死亡率,而且以后者症状更为突出,导致临床对本病的忽视,并且因为传统CIA血清学方法中的血清中和试验(SN)和间接免疫荧光试验(IFA)存在着费时、费力、对操作者技术要求高和仅适于实验室诊断的问题,因此,急需一种快速、简便、敏感、廉价和能检测大批量样品的诊断方法用于免疫鸡群的抗体监测和流行病学调查。 CIAV的VP1蛋白不仅是病毒的唯一衣壳蛋白,也是主要的免疫原蛋白。本试验用生物软件分析vp1基因及其编码产物,预测了该蛋白的抗原表位,并对预测的其富含抗原表位的C末端基因进行了原核表达。根据GenBank公布的标准毒株Cux-1基因序列,设计合成了一对引物,对CIAV-M9905株的vp1基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见一条1350bp的特异带,用Pstl酶切后,将其回收,克隆到pProEXHTa载体,再亚克隆到pGEX-6p-1载体中,得到重组质粒pGEX-vp1,PCR鉴定为阳性者再用BamHI消化阳性质粒,琼脂糖凝胶试剂盒回收大片段,自连后转化感受态细胞,用BamHI鉴定为阳性者命名为pGEX-vp1(C),得到目的克隆。 将重组刚性质粒pGEX-vp1(C)转入表达宿主菌BL_(21)中,经终浓度为0.6mmol/L IPTG诱导,成功表达了VP1 C端基因,重组蛋白表达量占菌体蛋白的39.4%。经ELISA检测表明,表达的重组蛋白能被CIAV阳性血清识别,具有良好的抗原性。 把表达的重组蛋白经初步纯化后用作包被抗原,建立了检测CIAV血清抗体的间接ELISA方法,并确定了最适封闭液、最适抗原包被浓度、最适血清稀释度、血清最适作用时间、酶标抗体最适稀释度和最适作用时间及底物最适显色时间。包被的重组抗原不与鸡新缄疫(ND)、马立克氏病(MD)、传染性支气管炎(IB)-Ⅰ型和Ⅱ型、禽流感(AI)-H9和H7型、鸡法氏囊病(IBD)、鸡网状内皮组织增生病(RE)、禽白血病(AL)-J亚群、鸡白痢阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA诊断方法只有良好的特异性。用该方法可检出人工攻毒后110天81%的CIAV血清抗体,表明其具有很高的敏感性。批内重复试验,变异系数小于10%;批间重复试验,变异系数小于15%,说明具有很好的重复性。与全病毒抗原检测结果符合率为92%以上,与进口试剂盒的符合率达97%。 本研究在国内首次成功表达了CIAV VP1蛋白抗原表位优势区,并成功建立了ELISA诊断方法。CIAV重组抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制,为免疫鸡群抗体监测和进行CIA流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S854.4

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 李彦;REV重组env蛋白间接ELISA诊断试剂盒的研制与应用[D];山东农业大学;2011年
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
2 王秀荣;鸡传染性贫血病的实验诊断与免疫机制的研究[D];东北农业大学;2000年
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4 刘岳龙;鸡贫血病毒中国株基因序列比较、病毒编码蛋白的表达及分子克隆化病毒的构建[D];扬州大学;2001年
5 郑世民;雏鸡感染鸡传染性贫血病毒后免疫变化和对新城疫疫苗的应答及其免疫机理[D];东北农业大学;2002年
6 孙建宏;NDV La Sota与V4株对鸡T细胞亚群影响及其F蛋白抗原优势表位的比较研究[D];东北农业大学;2003年
7 王玉娥;猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析[D];中国农业大学;2003年
8 朱瑞良;鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较[D];扬州大学;2003年
9 王春来;胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构与功能分析及其突变体的研究[D];中国农业科学院;2004年
10 孙照刚;传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组[D];中国农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孟斌;山东省白羽肉鸡免疫抑制病病原学和血清学调查[D];山东农业大学;2010年
2 杨明;鸡传染性贫血病毒与其它免疫抑制性疾病共感染的相互作用[D];山东农业大学;2010年
3 郭文龙;规模化肉鸡场主要免疫抑制性疫病的分子流行病学调查及传播特点分析[D];山东农业大学;2010年
4 吴萍萍;四种蛋传性病毒病多重PCR检测方法的建立[D];安徽农业大学;2010年
5 李强;张家口市鸡传染性法氏囊病毒VP2基因高变区变异性的研究[D];中国农业科学院;2010年
6 王传锋;猪繁殖与呼吸综合征新疆分离株N基因的克隆及原核表达[D];新疆农业大学;2010年
7 孙丹丹;CIAV M突变株致病性试验及其在DF-1上生长适应性的研究[D];河北农业大学;2011年
8 魏宗;鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达[D];山东农业大学;2011年
9 唐茂恒;烟台地区规模化肉种鸡场免疫抑制性疫病的流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
10 邹金峰;鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研究[D];山东农业大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前6条
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中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 孟日增;肖成蕊;王伟利;孟庆峰;宋战昀;石建平;;截短表达牛传染性鼻气管炎病毒gB基因及抗原性分析[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 石建平;牛传染性鼻气管炎(IBR)快速筛查方法的建立及应用[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
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中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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9 吉荣;崔治中;秦爱建;丁家波;刘岳龙;金文杰;;Ⅰ型马立克氏病病毒特异性核酸探针试剂盒的制备[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
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中国博士学位论文全文数据库 前8条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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